[发明专利]海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备及培养方法

说明书

技术领域：

本发明属于水产动物疾病研究领域，具体地涉及一种在水产动物体外实现海水盾纤毛虫活体长期培养的方法及其培养基的制备。

背景技术：

盾纤毛虫被公认为是海水养殖主要的一类病原体，国内外已经有多位学者研究报道了其对海水养殖造成的严重危害(Azusa Umehara，et al.2003，ESterud et al.2000)。一般情况下，盾纤毛虫营自由生活，以水中悬浮的微小有机颗粒(细菌、原生动物、微藻、有机碎屑等)为食。然而，在高密度养殖的情况下，盾纤毛虫通常可以转变为寄生性，以棘皮动物、贝类、甲壳类和鱼类的细胞或组织碎屑为食，并在寄主组织内快速生长、增殖，进而造成组织的深度伤害，形成严重的病灶，最终导致寄主的器官功能衰竭而死亡。

由于盾纤毛虫已经严重威胁到海水养殖的健康发展，中国水产科学研究院黄海水产研究所已先后对我国对虾、鱼类和海参的盾纤毛虫病进行了全面、系统的疾病流行病学研究，发现盾纤毛虫可感染中国对虾、牙鲆、大菱鲆、河鲀、海参等多种经济动物，并深入进行了盾纤毛虫的形态学观察(中国水产科学，2005年12卷第5期)和感染这些动物的病理学研究(水生生物学报，20075年31卷第5期)。同时，针对所分离的盾纤毛虫开展了中草药药物筛选(国家发明专利ZL200510044755.2)和防治工艺技术研究(国家发明专利ZL200510044757.1)。这些研究集中于对盾纤毛虫病的组织病理学和防治等方面，并未深入进行盾纤毛虫的生活史、致病机理等方面的研究。

为了科学的防治盾纤毛虫病，除了加强其防治技术研究外，开展虫体生活史和致病机理等基础理论研究也是十分必要的，而这方面的研究依赖于在体外对虫体进行长时间的活体培养。在本发明作出之前，国内外有关海水盾纤毛虫病的研究报道主要集中于流行病学、病原学、分类学、防治药物筛选等方面，只有学者R.Iglesias等人就盾纤毛虫虫体体外活体培养的营养需求进行过研究(In vitro growth requirements for the fish pathogen Philasterides dicentrarchi.Veterinary Parasitology，2003，111：19-30.)。他们主要利用含有多种成份的人工合成培养基在体外对纤毛虫进行持续培养，其培养基配方复杂，虫体培养时间也仅在10天左右。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备及利用该培养基进行海水盾纤毛虫体外活体培养的方法，培养基制备方法简单，能够实现盾纤毛虫活体在水产动物体外的长期培养，为深入研究盾纤毛虫的生活史、致病机理等基础理论研究提供必备的技术支撑。

本发明采用如下技术方案予以实现：

一种海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备方法，包括以下步骤：剪取健康牙鲆鱼或大菱鲆鱼的脑组织和肌肉组织，将两者按照质量比1∶1～3∶1的比例混合后，加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V₁，用组织匀浆机制备成肉泥；在肉泥中加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V₂，肉泥与两次加入的海水总体积的质量体积比为1∶45～1∶55，振荡均匀后置于密封、无菌的玻璃容器中，65～70℃水浴2～3小时后制备成盾纤毛虫活体培养基，制备好的盾纤毛虫活体培养基放置在4℃条件下长期保存。

进一步，所述的用于过滤海水的滤膜优选为孔径0.22μm的混合纤维素滤膜。

本发明还提供一种利用所述方法制备的海水盾纤毛虫体外活体培养的培养基。

本发明还提供一种海水盾纤毛虫体外活体培养的方法。

本发明是按如下技术方案实现的：

一种海水盾纤毛虫体外活体培养方法，具体步骤是：剪取感染盾纤毛虫病的养殖动物部分病灶组织，无菌操作在玻璃培养皿中剪碎后，滴入15～20倍体积的经滤膜过滤后的灭菌海水，置于18～20℃恒温培养箱内静置2～4个小时；在解剖镜下用无菌胶头滴管吸取静置后的培养皿内液体中游离的虫体，滴入装有15～30ml制备好的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，置于18～20℃恒温培养；每隔20～24小时，吸取5～10ml培养液转移至另一装有15～30mL新鲜的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，轻轻晃动数次混合均匀后，再将其置于18～20℃恒温培养箱继续培养，以此实现活虫体长期培养的目的，原培养皿中剩余的培养液用于虫体计数。

进一步，所述的用于过滤海水的滤膜优选为孔径0.22μm的混合纤维素滤膜。

本发明与现有技术对比的有益效果：