[发明专利]用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针。

背景技术

裂谷热(Rift valley fever，RVF)是一种严重的人兽共患病，也是自古以来流行于东非大峡谷地带的地方病，主要是在绵羊、山羊和牛中间传播，常可引起孕畜的流产风暴(abortion storm)，幼龄羊死亡率高达90％以上。该病的流行周期约为5-10年。该病可感染人，患者表现发热、头痛和关节痛等流感样症状，少数有出血热和脑炎表现，偶可引发视网膜炎以至失明，病死率约1％，表现出血热症状时死亡率可高达50％左右。RVF主要经蚊虫传播，具有明显的季节性，也可通过接触感染。

裂谷热病毒(RVFV)是白蛉热病毒属(Phlebovirus)，布尼病毒科(Bunyaviridae)成员，为一种单一血清型的病毒，具有布尼病毒的典型形态学和理化特性。病毒有囊膜，直径90～110nm，呈球形，表面有清楚的糖蛋白突起，突起直径长10nm。病毒核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链RNA，RNA可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。其中的S节段为双意义的RNA，即具有双定向编码功能，编码N蛋白和另外一种非结构蛋白(NSs)；M节段编码G1与G2两种外膜糖蛋白和两种非结构蛋白(NSm，大小分别为14kD和78kD)，G1和G2糖蛋白都能刺激机体产生抗体，但在体内只有G2能刺激机体产生中和抗体；L节段编码L蛋白，L蛋白具有病毒转录酶的功能。病毒粒子不含基质蛋白。目前还未发现RVFV的分离株和试验室传代株的特异性抗原差异，但已证明各毒株的致病性存在着一定差异。

目前，裂谷热病毒的诊断方法主要有病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、免疫荧光染色技术、血清学、分子生物学技术等诊断技术。其中病毒分离方法是RVF诊断最为高效敏感的方法，一直作为RVF诊断的经典方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占有很大优势，引起了众多研究者的关注。

荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在普通PCR一对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种检测裂谷热病毒的荧光RT-PCR法。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针，上游引物RVFVU1：5’-GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3’，下游引物RVFVL1：5’-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3’(R为A或G，W为T或A)，探针RVFVP1：5’-F1-ACTCCACTGACACAACACGACGACCACT-Q1-3′；其中，F1为报告荧光基团，Q1为淬灭荧光基团。优选F1为FAM，Q1为ECLIPSE。其中F1还可以是FAM、HEX、TET等荧光基团，对应的Q1还可以是TAMARA、BHQ、MGB等淬灭基团。

本发明还提供检测裂谷热病毒的荧光PCR法，其以样品RNA为模板，用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，根据扩增曲线判定样品中是否携带裂谷热病毒。

25μL的反应体系含有成分如下：10×PCR缓冲液(Mg²⁺)2.5μL；2.5mM MgCL₂ 5.0μL；2.5mM dNTP 2.5μL；反转录酶AMV 2.5U；Rnase抑制剂20U；10μM RVFVU1 0.5μL；10μM RVFVL1 0.5μL，10μMRVFVP1 0.5μL，rTaq聚合酶2.5U；RNA模板1.6×10^-6～1.6×10^-1ng，余量为双蒸水；

反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，47℃退火20s，45个循环，每个循环结束时采集FAM通道荧光信号。