[发明专利]用于表达miRNA和/或蛋白的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于表达miRNA和/或蛋白的表达载体及其应用。

背景技术

miRNA是真核生物中一类长度约为22核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，成熟的miRNA是由较长的可折叠形成发卡结构的前体转录物经过Dicer酶或类似于Dicer酶的内切核酸酶加工而来。miRNA基因存在于基因组的间隔区域或者内含子当中。这些小分子的RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’UTR区结合来调控基因的表达。目前人们对miRNA的生物合成过程已经了解比较清楚，细胞内编码的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下发生转录，形成长度约为几百个核苷酸的初级转录产物pri-miRNA，初级转录产物在RNaseIII家族酶-Drosha的参与下被加工成只含60-70nt具有茎环结构的单个miRNA前体pre-miRNA；在另一个RNaseIII家族酶-Dicer的参与下，miRNA前体被加工为双链的miRNA，随后接连形成单链成熟的miRNA。miRNA的转录所需的转录酶与蛋白表达所需的转录酶都属于RNA聚合酶II，因此可以使用同一个II型转录启动子。

目前较为常用的miRNA表达载体一般是在利用某一特定的miRNA基因的5’-flanking region和3’-flanking region作为克隆位点来连接体外合成发卡形状的miRNA的前体。由于miRNA在基因组中的位置的特殊性，决定了在体外情况下，普通的miRNA表达载体中无法插入外源蛋白进行表达。这就限制了载体的用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于表达miRNA和/或蛋白的表达载体。

本发明所提供的表达载体是由线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和两端各有一个粘性末端的双链DNA片段连接而成的环状表达载体；所述线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA片段的两个粘性末端相连，并且两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I的识别位点。限制性内切酶BsmB I的识别位点及酶切位点为：

              3’-......GCAGAG(N)_5▲......-5’

上述序列中带下划线部分为限制性内切酶BsmB I的识别位点，三角形代表酶切位点。BsmB I切出的位点有四个碱基的粘性末端，这几个碱基是随机的碱基，没有序列特异性，因此可用BsmB I切出pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR粘性末端的四个碱基，这样就不会破坏pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体自身携带的flanking region的核苷酸序列也就不会影响miRNA的表达，因此发明人设计使所述两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I的识别位点。

实际操作中，可在所述双链DNA片段的内部添加限制性内切酶Dra I的识别位点。关于Dra I的设计，在图1中可以看出在5’侧翼序列(5’-flanking region)的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有Dra I酶切位点，在此序列的后面有终止密码子(后一个Dra I后，5’-flanking region前面，miRNA的表达不受影响)，因此，此线性的末端不能直接连接蛋白表达。在试验中，本发明人在插入的多克隆位点中间加入一个Dra I酶。加上插入的Dra I，该质粒中共有三个Dra I位点，用Dra I酶切正好切除EmGFP和5’-flanking region的区域，而不破坏EmGFP前面的启动子，因此蛋白可以正常表达。

所述DNA片段的一条链为如下a)-c)中：

a)其核苷酸序列为序列表中序列2；

b)其核苷酸序列为在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之间再插入1-50个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列：5′-CGTCTC-3′；

c)其核苷酸序列为序列表中序列4；

所述DNA片段的另一条链为如下d)-f)中的任一种：

d)其核苷酸序列为序列表中序列3；

e)其核苷酸序列为在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之间再插入1-50个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列：5′-CGTCTC-3′；