[发明专利]30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开发的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱-串联质谱技术对样本中30种氨基酸进行高灵敏度定量检测的方法。

本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有30多种。生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，而氨基酸正是蛋白质的基本单位，所以如果人体氨基酸发生变化，不在正常值范围内，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。目前氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种，涉及代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。

氨基酸在医药上也有广泛应用。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。因此，检测复杂样本中氨基酸的含量对临床检验、工业生产和科学研究等都具有重要意义。

1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、液相色谱法等相继应用于氨基酸分析。传统的氨基酸分析技术已很难满足极微量氨基酸的准确和高通量检测需求。

液相色谱-串联质谱技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样本在液相色谱质谱部分分别被分离及离子化，经检测器得到质谱图，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内外定性和定量分析的实用方法。研究开发一种结果准确、严格区分同分异构体、分析通量高、价格低廉、操作简便、易于推广的30种氨基酸LC-MS/MS同时定量检测试剂盒，使其能广泛应用于复杂样本中氨基酸临床、科研和工业生产，将有助于提高氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，以满足临床检验、工业生产和科学研究等对氨基酸定量检则的需要。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

技术方案

本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定复杂样本中30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)浓度的新型试剂盒。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇为衍生化试剂进行处理，吹干复溶后上清液进行LC-MS/MS检测，记录氨基酸和内标的峰面积。根据氨基酸对应稳定同位素内标浓度、样本中的氨基酸/对应同位素内标峰面积比值即可计算出每种氨基酸的浓度。测定结果为复杂样本中氨基酸浓度。

本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤：

1.稳定同位素内标冻干粉：12种稳定同位素标记氨基酸对照品冻干粉(含²H₄；5-¹³C-精氨酸、²H₃-亮氨酸、²H₃-甲硫氨酸、¹³C₆-苯丙氨酸、²H₃-天门冬氨酸、²H₂-瓜氨酸、²H₃-谷氨酸、²H₈-缬氨酸、¹³C₆-酪氨酸、²H₄-丙氨酸、²H₃-鸟氨酸均0.5pmoL；含¹⁵N；2-¹³C-甘氨酸2.5pmoL)，贴签标记，完成操作。