[发明专利]细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域及组织工程领域中的细胞培养载体，特别涉及一种具有温敏性的共聚纳米复合水凝胶与其在细胞培养和细胞片的自发快速脱附中的应用。

背景技术

20世纪以来，聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)在生物医学领域及组织工程领域得到了广泛应用，包括药物控制释放，基因表达，层析分离生物分子等，特别是，利用PNIPAm的温度敏感性来获得完整无损伤细胞片的方法受到人们的普遍关注。PNIPAm由于其分子链中同时具有亲水基团与疏水基团，当温度高于其低临界溶液温度(LCST)32℃以上时，分子链与水分子间的氢键被破坏，疏水相互作用加强，呈现疏水性，适合细胞贴附、增殖；当温度降低到LCST以下时，酰胺基团参与氢键的形成，分子链伸展，PNIPAm发生疏水-亲水转变，生长在其表面的细胞能发生自动分离。这种方法避免了组织工程中常使用可降解生物支架而导致组织纤维化和产生炎症，同时避免了常规细胞培养方法使用胰酶对细胞外基质及细胞间连接的损坏，保持了细胞的生物活性，是一种新的获得细胞片的组织工程方法。

传统PNIPAm水凝胶的强度及韧性低，响应速率慢，这些缺陷使得凝胶在许多方面的应用受到限制。Haraguchi等(Adv. Mater., 2002, 14:1120-1124)首次将锂藻土(Laponite)纳米粒子分散在水中，使N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)单体在Laponite分散液中原位自由基聚合，得到了PNIPAm/Laponite纳米复合水凝胶。这种纳米复合水凝胶不仅拉伸强度约为常见水凝胶的10倍，而且断裂伸长率高达1300％，约为常见水凝胶的50倍；韧性高；透明性好。这种力学性能优良的温敏性凝胶成功应用于人肝肿瘤细胞(HepG2)、人真皮成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养并通过降低温度实现细胞自发脱附(Biomacromocules, 2006, 7:3267-3275)。

另有研究报道(Biomaterials, 1995, 16(4): 297–303)，细胞脱附受到PNIPAm疏水-亲水转变及细胞代谢水平的影响，降低温度可提高PNIPAm的水化程度，但是温度太低又会抑制细胞代谢活动，反而减慢细胞脱附过程。聚乙二醇(PEG)是常见的人工合成生物高分子，无毒、具有良好的生物相容性。同时，PEG大单体与NIPAm共聚制备的水凝胶，在温度降低时，亲水性PEG会加快凝胶的溶胀过程，其亲水基团能够减少材料表面和蛋白质之间的吸附力，使得细胞片从材料表面自发快速地脱附下来。

因此，我们将含甲基丙烯酸端基的亲水性聚乙二醇(PEG)大单体与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)单体在Laponite悬浮液中共聚制备纳米复合水凝胶体系，在保持水凝胶高强高韧的力学性能及温度敏感性的基础上，通过引入生物相容性的亲水性PEG得到既适合细胞生长增殖又能使细胞片自发快速脱附的纳米复合水凝胶。

发明内容

本发明的目的和内容在于针对现有凝胶材料的缺陷和不足，提供细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶及其制备方法与应用。本发明制得的细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶能作为细胞培养载体，解决细胞组织工程中存在的上述问题。该凝胶既具有良好的力学性能和温敏性，又适合细胞生长，并可以通过降低凝胶所处环境温度实现细胞片从水凝胶表面快速自动脱附。

本发明所制备的细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶，是由N-异丙基丙烯酰胺单体和含甲基丙烯酸端基的聚乙二醇亲水性大单体在锂藻土Laponite悬浮液中原位自由基聚合制备而成。本发明的目的通过下述技术方案实现。

细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将锂藻土分散于水中，搅拌得到均匀透明的分散液。

（2）然后依次加入PEG大单体、 NIPAm单体。

（3）搅拌均匀后除氧，加入引发剂，搅拌后将反应液注入玻璃试管及自制反应模具中密封。

（4）将反应体系置于15 ~ 25℃下反应即得到锂藻土交联的共聚纳米复合水凝胶。

上述制备方法中，锂藻土相对于整个反应体系的质量百分比浓度为2% ~ 7%，NIPAm单体相对于整个反应体系的质量百分比浓度为8% ~ 10%，PEG大单体相对于整个反应体系的质量百分比浓度为0.06% ~ 10%，引发剂相对于整个反应体系的质量百分比浓度为0.1% ~ 0.2%。