[发明专利]一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法

权利要求书

1.一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理制剂的制备：

样品前处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液需现配现用；所述的萃取裂解缓冲液的配制：用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2 %质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30，100 mM的一水柠檬酸，0.5 %体积比的Tween 20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存；所述的染色缓冲液的配制：1mg 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐溶于浓度为400 mM的Na₂PO₄·12H₂O缓冲液500mL中，用蒸馏水配制，pH为9；

（2）单细胞悬浮液的制备：

切取0.2～0.5 m²洁净的非洲菊大孢子再生试管苗幼叶置于平底培养皿中，加步骤（1）所述的萃取裂解缓冲液400μl，用刀片从纵横两个垂直方向快速将小叶片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光静置萃取2～5min，后再加步骤（1）所述现配制的染色缓冲液1600 μl混匀，避光静置染色5～8min，30μm滤网过滤，滤液收集于流式细胞仪机用标准样品管，所收集的滤液即为单细胞悬浮液；

（3）对照及待测样品的流式细胞术倍体水平鉴定

设置已知倍性的非洲菊试管苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号流式细胞仪测定，流式细胞仪激发光源为20mW、488nm的蓝宝石固体激光；测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道畅通，喷嘴清洁；控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度；通过与CyFlow? Cube型号流式细胞仪相连的Partec CyView 85计算机分析软件，调整电压设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平，具体是：

①以已知的二倍体非洲菊试管苗为对照时，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定；

②以已知的非洲菊大孢子再生单倍体植株试管苗为对照时，将对照样品DNA含量荧光强度分离峰设置在横坐标50的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为双单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5%的位置时，该待测样品为四倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定。