[发明专利]一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，属生物技术领域，专用于非洲菊大孢子再生植株倍性的快速鉴定。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonil Bolus)又名扶郎花，为菊科大丁草属植物，其花色艳丽，可用作切花生产或盆栽观赏，全世界广泛分布，是一种观赏价值较高的花卉。目前，生产中迫切需要耐低温、耐弱光、抗疫病和抗病毒病的优质高产非洲菊新品种，但常规育种周期长而且变异谱范围有限，不易捕捉目标性状。通过花粉(花药)培养获得双单倍体是高效利用种质资源和提高选育效率的一种方法。

非洲菊为典型的异花授粉作物，自交衰退严重，且雄配子诱导反应较差，而且其特殊的花器构造导致花粉或小孢子培养的外植体灭菌难度较大，难以获得成功，因而，通过离体大孢子培养获得单倍体尤其具有独特的价值，并成为目前获得非洲菊双单倍体的唯一可行途径，可加速育种材料纯化，缩短育种周期，加速育种进程。

然而，通过非洲菊大孢子培养获得的再生大孢子植株群体或非洲菊单倍体经秋水仙碱处理的组培苗植株，在这些植株中，除育种家需要的单倍体、双单倍体(Doubled Haploid，DH)植株外，还包含四倍体及非整倍体等，育种家必须花费大量的时间来鉴别真正的单倍体和双单倍体植株。有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用大孢子再生植株的基础，特别是大量的非洲菊大孢子再生植株和大孢子再生单倍体植株经秋水仙碱处理的试管苗前期倍性鉴定，不仅可以大大减少育种工作量，加快育种进程，而且可以提前进行分子标记辅助选择和遗传图谱构建工作。 

    另外，非洲菊从苗期到开花期，没有明显的形态学性状可用于区别不同的倍性水平。尽管在开花期单倍体可能产生不正常的花和败育的花粉，个别四倍体植株可能产生较大的花，但二倍体和四倍体（如非洲菊品种‘金葵花’）仍然难以区别。因此，长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性，主要方法有：花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等。这些显微方法不仅费时，而且技术难度大。此外，采用花粉大小判别法需在开花期进行，占地且费时；而采用保卫细胞长度测量法，由于单倍体和二倍体以及二倍体和四倍体的保卫细胞长度重叠而不准确。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM) 是在单细胞水平上，应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒的理、化及生物学特性进行分析的方法。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。目前，流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，但在植物方面的应用直到20世纪80年代中期才开始。由于流式细胞仪可以直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平，不受植株生长发育时期和环境条件的影响，不仅省时、高效，而且还可以快速、直观、高效的检测出非整倍体和混倍体。目前已被成功地用于花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、葡萄、大白菜、猕猴桃植株的倍性鉴别上，但由于各种作物的遗传物质和倍体有所差异，运用流式细胞术对其进行倍性鉴别有特殊的要求，所以，至今还未见用流式细胞术用于非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定报道。

发明内容

本发明提供一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法。针对上述现有技术中非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定存在的问题，将流式细胞仪应用到非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定上，建立非洲菊大孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系，从而提高非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定效率，加速育种材料的选育和遗传图谱的构建。

一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理制剂的制备：

样品前处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液需现配现用；

所述的萃取裂解缓冲液的配制：

用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2 %质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30(Polyvinyl Pyrrolidone K30，PVPK30)，100 mM的一水柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O），0.5 %体积比的Tween 20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存；

所述的染色缓冲液的配制：