[发明专利]一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法

权利要求书

1.一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法，包括以下步骤：

a：标准曲线的建立步骤：

在建立邻苯二甲酸二乙酯的标准曲线之前，先配制不同浓度的标准品：邻苯二甲酸二乙酯标准品用1-2mL的无水乙醇溶解后，用稀释液稀释至一系列浓度，分别为0.0048ng/ml、0.0097ng/ml、0.14ng/ml、0.29ng/ml、1.2ng/ml、2.3ng/ml、9.3ng/ml、18ng/ml：竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过Origin6.0软件处理后绘制成标准曲线；

(1)包被步骤：

用邻苯二甲酸二乙酯包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；

(2)封闭步骤：

在包被好的酶标准版中加入1％卵清蛋白溶液，每孔150μL，37℃温育30min后，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL邻苯二甲酸二乙酯标准溶液和50μL邻苯二甲酸二乙抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；

(4)显色步骤

每孔加入100μL酶标羊抗兔抗抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；每孔加入100μL底物液，37℃下温育30min，从培养箱内取出，每孔加入50μL终止液；

(5)检测步骤：

用多功能酶标仪测定各孔在波长为490nm吸收光强度；

b：样品的检测步骤

除(3)竞争步骤：每孔加入50μL样品溶液和50μL的邻苯二甲酸二乙酯抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

2.根据权利要求1所述的一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法，其特征在于：除(3)竞争步骤：每孔加入25μL样品和25μL邻苯二甲酸二乙酯标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二乙酯抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

3.根据权利要求1所述的一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法，其特征在于：

所述的邻苯二甲酸二乙酯包被抗原通过以下方法制备：

称取4-氨基邻苯二甲酸二乙酯0.0245g，溶于150μL浓盐酸(12mol/L)中，加入3mL蒸馏水，在冰水浴(0-4℃)中搅拌；加入2mL 0.1mol/L的NaNO₂溶液，搅拌30min后，再加入0.001g尿素，除去未反应的NaNO₂；再加入25ml溶有126mg卵清蛋白的四硼酸钠的溶液，冰水浴(0-4℃)搅拌3-6h后，将反应液装入透析袋，在蒸馏水中透析7天，每天换水两次，得棕红色邻苯二甲酸二乙酯包被抗原溶液(4mg/ml)。

4.根据权利要求1所述的一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法，其特征在于：所述的酶标羊抗兔抗抗体通过以下方法制备：

取辣根过氧化物酶10mg溶于0.4mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，待溶解后加入体积分数25％戊二醛0.1mL，然后37℃温育2h；之后加入0-4℃的无水乙醇2mL，2500r/min离心15min，倾去上清液；

取沉淀以体积比80％乙醇4mL混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出；

沉淀用1mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入羊抗兔抗抗体3mg，放在冰箱内4℃过夜后，加入0.5-2mgNaH₂PO₄，调至溶液pH7-8，即可，制备好的酶标羊抗兔抗抗体放置在4℃保存。