[发明专利]一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种邻苯二甲酸二乙酯的检测方法。

背景技术

2011年4月份以来，在台湾发生的食品添加物起云剂中加入有害健康的塑化剂事件引起轩然大波。塑化剂是一种对树脂或塑料或橡胶或粘合剂等高分子材料有溶剂化作用的一类功能性化学品，是一种高分子材料助剂，常用的增塑剂是邻苯二甲酸酯。研究信息表明，邻苯二甲酸酯对环境和人体可能存在不良影响。欧盟是最早对邻苯二甲酸酯的应用做出限制的国际组织。欧盟2005/84/EC指令列出了六种邻苯二甲酸酯物质DEHP、DBP、BBP(邻苯二甲酸丁苄酯)、DINP、DIDP(邻苯二甲酸二异癸酯)、DNOP(邻苯二甲酸二正辛酯)进行限制，其中前三种DEHP、DBP、BBP不得用于儿童玩具和用品中，在塑料中的含量每种不得超过0.1％。后三种DINP、DIDP、DNOP不得用于能入口的儿童玩具及儿童类物品中，每种含量不得超过0.1％。

目前邻苯二甲酸酯类的检测技术主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、薄层色谱法等。最常采用的检测技术是气相色谱法和液相色谱法，但是监测费用昂贵，需专业人员操作，样品前处理烦琐，很难进行批量处理，难以适应食品业快速诊断的形势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、检测限低、快速简便的从食品样品中测定邻苯二甲酸二乙酯的方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种邻苯二甲酸二乙酯的方法，包括以下步骤：

a：标准曲线的建立步骤：

在建立邻苯二甲酸二乙酯的标准曲线之前，先配制不同浓度的标准品。邻苯二甲酸二乙酯标准品用1-2mL的无水乙醇溶解后，用PBS稀释液稀释至一系列浓度，分别为0.0048ng/ml、0.0097ng/ml、0.14ng/ml、0.29ng/ml、1.2ng/ml、2.3ng/ml、9.3ng/ml、18ng/ml。竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过Origin6.0软件处理后绘制成标准曲线。

(1)包被步骤：

用邻苯二甲酸二乙酯包被抗原(DEP-OVA)包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次。

(2)封闭步骤：

在包被好的酶标准版中加入1％卵清蛋白(OVA)溶液，每孔150μL，封闭没有包被抗原的多余的部分，避免抗体的非特异吸附在酶标板上。37℃温育30min后，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL邻苯二甲酸二乙酯(DEP)标准溶液和50μL邻苯二甲酸二乙抗体使之发生竞争反应。37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；以除去游离的DEP及抗体结合物。

(4)显色步骤

每孔加入100μL酶标羊抗兔抗抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；以除去游离酶标羊抗兔抗抗体。每孔加入100μL底物液，37℃下温育30min，从培养箱内取出，每孔加入50μL终止液。

(5)检测步骤：

用多功能酶标仪测定各孔在波长为490nm吸收光强度。

b：样品的检测步骤

除(3)竞争步骤：每孔加入50μL样品溶液和50μL的邻苯二甲酸二乙酯抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

为了建立方法的重复性好，以及检测的准确度，需要在样品中加入标准品，进行加标回收实验。

除(3)竞争步骤：每孔加入25μL样品和25μL邻苯二甲酸二乙酯标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二乙酯抗体，37℃下温育3h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

所述的邻苯二甲酸二乙酯包被抗原通过以下方法制备：