[发明专利]对高等植物复杂基因组基因进行富集建库和SNP分析的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种建立高等植物复杂基因组基因文库的方法。

背景技术

限制性酶切位点关联DNA(restriction-site associated DNA，RAD)标记技术是指一种将基因组DNA用限制性内切酶消化后，对酶切位点区域进行序列分析的技术。RAD标记应用初期是使用基因芯片技术来对RAD标记进行分离。例如，Lewis等(2007)使用NotI对粗糙链孢菌DNA进行了酶切，之后用基因芯片对NotI酶切位点区域进行了序列分析，并完成了对突变位点的作图；Miller等(2007)用基因芯片技术分析了斑马鱼基因组的EcoRI标记，也完成了对突变位点的作图；Miller等(2007)测试了使用RAD基因芯片对生物单体以及分离群体进行基因分型，结果显示，在模式生物与非模式生物中，RAD标记都能很好的进行分型。虽然基因芯片技术能够高密度的寻找生物体基因组中的RAD标记，但是由于其价格昂贵，限制了应用芯片技术的RAD标记的应用。

近几年来，由于第二代测序技术的逐渐普及以及相比于芯片技术的价格低廉，发展了使用第二代测序技术对RAD标记进行分析的方法。例如，Baird等(2008)开发了一套利用Illumina测序技术对RAD标记附近区域进行测序的建库方法，该方法在寻找SNP与RAD标记作图方面取得了很好的效果。Hohenlohe等(2010)应用第二代测序技术对RAD标记区域进行测序，在5个三刺鱼群体共100个个体中找到了45000个SNP位点。Chutimanitsakun等(2011)以大麦为模式生物，评测了RAD测序技术在QTL方面的应用。Pfender等(2011)使用RAD测序技术构建的连锁图能够快速分辨出黑麦草茎的抗锈病基因的QTL位点。截至目前，RAD技术已经在制作遗传连锁图、基因分型、QTL定位等方面得到了越来越广泛地应用，特别是在无参考序列的情况下寻找酶切位点附近区域SNP时展现出独特优势。目前，RAD测序技术在建立文库时使用的主要是NotI、EcoRI以及SbfI等酶。

已报道的RAD测序技术的研究对象大多数都是基因组构成较为简单的生物。某些高等开花植物含有复杂的基因组，例如玉米基因组中80％以上是重复序列(Schnable等，2009)。重复序列区的大多数CG序列的胞嘧啶出现甲基化现象(Methylation)，表示为5mC。而在基因区中的CG序列的胞嘧啶很少发生甲基化(Gruenbaum等，1981；Vanyushin等，2011)。在研究这些复杂基因组时，常规的RAD建库方法得到的基因组文库中含有大量的重复序列，不能起到富集基因组基因区的作用。

虽然现有技术中已经有对高等植物基因组基因区富集的方法，例如过滤掉甲基化序列的MF(Methylated Filtration)(Palmer等，2003)、过滤掉高拷贝序列的HC(High-Cot)(Yuan等，2003)、亚甲基部分限制HMPR(Hypomethylated Partial Restriction)等，但是Emberton等(2005)的结果表明，上述三种方法构建的文库基因序列分别仅可以达到总序列的33.8％、23.4％、25.8％。本领域仍然需要一种适用于具有复杂基因组的高等植物的基因区建库方法。

发明内容

鉴于在研究某些含有复杂基因组的高等开花植物时，常规的RAD建库方法得到的基因组文库中含有大量重复序列，给后续的信息分析造成干扰的事实，本发明提供了一种新的建库方法。在本发明的方法中，使用甲基化敏感酶替代常规的非甲基化敏感酶对基因组进行酶切，之后进行建库。

在一方面中，本发明提供了一种适合含有复杂基因组的高等开花植物的建库方法，包括如下步骤：

1)用甲基化敏感酶对从一个或多个样本提取的基因组DNA进行酶切，获得DNA片段；

2)对所述DNA片段进行第一接头连接，获得具有第一接头的连接产物，其中在多个样本基因组DNA的情况下，每种样品的DNA片段连接的第一接头带有不同标签序列，并将连接第一接头后的连接产物混合；

3)对所述具有第一接头连接产物进行打断及片段回收，获得回收产物；

4)对所述回收产物进行末端修复，获得经过末端修复的DNA片段；

5)对所述经过末端修复的DNA片段的3′端加碱基A，获得具有粘性末端A的DNA片段；

6)对所述具有粘性末端A的片段进行第二接头连接，获得具有第二接头的连接产物；