[发明专利]一种木质素降解酶及其制备方法与它的用途

权利要求书

1.一种木质素降解酶的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：

A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；

B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下培养8～12天；

C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；

D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C)中，所述的发酵混合物在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，该制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴。

所述的透析是使用分子量8000的透析袋，使用pH7.2、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行透析24h，每间隔8h更换一次所述的磷酸盐缓冲液。

所述的柱层析是使用DEAE-Sephadex A-50柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度为2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及含木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活力，收集具有酶活的组分。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在制备漆酶时，该制备方法包括超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析与DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴；

在超滤浓缩步骤得到的浓缩液使用以重量计65％硫酸铵溶液进行沉淀，让这种沉淀与母液在温度4℃下放置过夜，然后以转速10000r/min进行离心20min，得到的沉淀用最少量的10mmol/L pH5.0醋酸盐缓冲液溶解；

得到的溶液再使用分子量8000的透析袋，使用蒸馏水进行透析48h，每间隔12h更换一次蒸馏水；

然后，得到的透析液进行离子交换分离，使用DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，使用0.1～0.5mol/LNaCl盐溶液以洗脱速度2.0mL/min进行线性洗脱，每隔10min收集一管洗脱液，每管4mL，检测每管洗脱液的蛋白含量及漆酶活力，收集具有酶活的组分。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述方法制备得到的木质素降解酶，其特征在于它含有含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，其重量比是1∶0.5-3.0∶0.8-3.0。

8.根据权利要求7所述的木质素降解酶在降低烟草梗丝木质素中的用途。