[发明专利]一种木质素降解酶及其制备方法与它的用途

说明书

【技术领域】

本发明涉及烟草加工技术领域。更具体地，本发明涉及一种木质素降解酶及其制备方法，还涉及所述木质素降解酶的用途。

【背景技术】

烟草梗丝的主要成分是木质素、纤维素和果胶等，而木质素是造成梗丝杂气、木质气重及燃烧时产生灼喉刺激感的主要原因。

木质素是一种芳香族高分子化合物，通过形成交织网来增强细胞壁及黏合纤维，具有抗压作用。

木质素分为紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)，愈创木基木质素(guajacyl lignin，G-木质素)和对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H-木质素)。

烟草细胞壁物质中的木质素是由苯丙烷衍生物单体(如香豆醇、松柏醇和芥子醇等)构成的一种结构复杂的立体网状物质，是具有生物多态性的生物大分子，其填充在纤维素和半纤维素的空隙之中，紧密结合形成了致密的细胞壁结构。木质素普遍存在于烟草梗丝中，对卷烟抽吸品质的影响很大，在吸食过程中木质素受高温热解会产生儿茶酚、烷基儿茶酚等引起涩口等令人不愉快的感官效果，同时，研究表明这些物质可能存在一定的致癌活性，因此，如何安全有效的降低梗丝木质素成为须解决的一个重要问题。

目前，CN03144088公开了烟草梗丝加工方法，其中包括筛分、水洗、切梗、闪蒸、膨化干燥等步骤。CN01108471公开了烟草梗丝微波膨胀工艺，CN200810197102公开了一种烟草梗丝的制备方法，其中包括烟梗浸泡、蒸气加温、储梗、切梗、烘干膨化等步骤，这些方法都是物理加工方法。

随着生物技术的进步，烟草工作者已开始研究木质素降解酶的应用。目前该方面报道不多，工业化生产木质素降解酶制剂及应用于烟草梗丝处理鲜见报道。因此，本发明人利用微生物发酵工艺生产木质素降解酶(木素过氧化物酶Lip、锰过氧化物酶Mnp和漆酶Lac)，有针对性地降低烟草梗丝木质素含量，改善抽吸时木质气重及灼喉刺激感。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种木质素降解酶。

本发明的另一个目的是提供所述木质素降解酶的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述木质素降解酶的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种木质素降解酶的制备方法。

该木质素降解酶制备方法的步骤如下：

A、在常压与温度90～100℃的条件下，烟草梗丝按照其与水的重量比1∶100～500用水煮2.0～3.0h，得到一种固液混合物；

B、然后，按照烟草梗丝量2～10g/L，往步骤A)得到的固液混合物中添加10～20g/L葡萄糖、0.05～0.30g/L酒石酸铵、0.05～0.30g/L尿素、5mmol/L藜芦醇、1mL/L微量元素混合液，混合均匀后得到的混合液作为培养基；然后分装，在温度121℃与0.1Mpa的条件下灭菌18～25min，冷却后按照接种量以所述培养基体积计6～15％接种白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌种，然后在温度28～32℃与转速140～160r/min的条件下培养8～12天；

C)将步骤B)培养得到的发酵混合物通过离心分离得到上清液，弃去沉淀；

D)将步骤C)得到的上清液采用超滤浓缩、用分子量8000的透析袋透析，再采用DEAE-Sephadex A-50柱层析或DEAE-Sepharose-F.F.离子交换处理进行纯化，检测洗脱液蛋白含量及含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活力，得到含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的烟草梗丝是烟草上、中和下部的长梗。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C)中，所述的发酵混合物在温度0～4℃与4000～6000r/min的条件下进行离心15～25min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的微量元素混合液含有1-2g/L硼酸、0.02-0.05g/L钼酸钠二水合物、1.2-2.0g/L氯化锰四水合物、0.1-0.4g/L硫酸锌七水合物与0.05-0.20g/L硫酸铜五水合物。

根据本发明的一个方面，在制备含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶时，该制备方法包括超滤浓缩、透析与柱层析步骤；

所述的超滤浓缩是使用0.001～0.02μm微孔超滤膜在压力0.1～0.5MPa的条件下进行超滤分离，其超滤膜的Mr＝1.0×10⁴。