[发明专利]高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法。

背景技术

伴随石油化工的发展，合成塑料已成为人们生活和生产密不可分的工业产品。但是大量不可降解塑料的废弃已造成愈来愈严重的“白色污染”，日益威胁着人类赖以生存的环境，因此开发可生物降解的塑料已成为当务之急。目前采用生物技术生产的生物可完全降解的塑料中，研究得比较多的有两类：聚乳酸和聚羟基烷酸酯。尤其后者的物化性能与聚丙烯相近，还具有生物相容性、光学活性、压电效应、低透氧性、抗紫外线和抗凝血性等许多独特的优点，在医用产品领域也有广泛的用途。

临床医学研究表明：含苯基功能团的有机物苯乙酸和苯丁酸等具有抗肿瘤、镇痛和化学预防治疗等功能。如果将苯基功能团引入生物高分子聚合材料----聚羟基烷酸酯中，合成出具有优良物理化学和机械性能的含苯聚羟基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解过程中缓慢释放出含苯基功能团的有机酸如苯乙酸、苯丁酸等的特点，从而使生物可降解医用材料聚羟基烷酸酯在使用过程中具有抗肿瘤、镇痛等新的医学作用，可为扩大该类生物高分子材料在医学方面的应用奠定良好的基础。

不含苯基功能团的聚羟基烷酸酯的生物合成技术已经基本成熟，如利用发酵法合成聚羟基丁酸酯(PHB)的浓度可达到每升140克，合成的羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的浓度能达到每升50～90克左右，这使它们的生产成本大幅度降低，具备了工业化规模生产的条件。但是利用微生物以含苯有机物(如苯戊酸、苯乳酸等)为碳源合成含有苯基功能团的聚羟基烷酸酯时，由于通常微生物代谢含苯有机物的速率较低，而且有机物碳源对细胞生长有明显抑制作用等原因，使得最终得到的细胞浓度和产物浓度都较低。近期报道的两段流加式高密度发酵合成聚羟基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有机物碳源对细胞生长抑制作用，从而使得发酵果汁最终得到的细胞浓度可以达到35.3克/升，产物聚羟基苯烷酸酯的浓度达到12.3克/升。但此发酵过程仅仅利用单一菌种Pseudomonas putida发酵合成含苯羟基烷酸酯共聚物，其中的单体绝大部分都是中长链(六个碳或以上)烷酸酯单体，短链(4个碳或以下，或5个碳)烷酸酯单体含量低，导致其材料难于加工成型，应用范围受到很大限制。

此外，利用单一菌种微生物发酵合成含苯聚羟基烷酸酯时，因微生物特性所定，其代谢产物含苯聚羟基烷酸酯往往主要由短链单体组成，或者主要由中长链单体组成，很难调节和控制含苯聚羟基烷酸酯产物中短链单体和中长链单体的比例，以使其产物的物理化学性能难以调控，大大地限制了它的使用范围。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给来合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成的高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，主要将两种或两种以上的微生物接种到同一发酵罐内进行混合培养，为了实现高密度发酵，整个发酵分两个阶段完成：

(1)第一阶段：首先在发酵培养基中加入不大于0.5g/L的含苯有机物和5～20g/L的糖作为碳源，然后接入两种或两种以上的微生物种子液于发酵培养基中，并在发酵罐中进行发酵培养，以1vvm的流量将无菌空气或富氧气体(如工业级的氧气)连续通入搅拌釜式发酵罐内，控制发酵罐的搅拌转速为150～800转/分钟，发酵温度为微生物生长的适宜温度，发酵液中溶解氧浓度高于微生物生长代谢的需求值；并利用氨水调节pH为微生物生长的适宜pH值(如果不用氨水而用氢氧化钠溶液来调节pH值时，在发酵过程中需要补给一定量的氮源如硫酸铵，以保证发酵过程中微生物对氮的需求量)；发酵过程中利用在线信号(如溶氧浓度、pH、在线糖浓度分析仪等)判断发酵过程中碳源(糖和含苯有机物等)的消耗量，适时流加碳源以保证微生物的生长所需碳源；

(2)第二阶段：当微生物细胞吸光密度达到30(600nm波长下的测量值)后，利用不含氮的碱性溶液来调节pH值，并停止补加氨水和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量逐渐降低至0.001mol/L，造成发酵液中氮源供给不足实现氮限制；并随时监控溶解氧浓度和pH值的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加碳源，微生物就会将发酵液中的碳源通过微生物代谢合成转化为含苯聚羟基烷酸酯。