[发明专利]一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法

权利要求书

1.一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于：将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌，并采用特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除，电击缓冲液的碱金属可促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来，提高质粒消除率。

2.如权利要求1所述的将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌，其步骤如下：

A、制备感受态细胞：

(1)从LB平板上挑取含抗生素抗性质粒的大肠杆菌单菌落，接种到含有5ml的LBG培养基中培养过夜；

(2)在无菌条件下，将细菌转移至预冷、无菌1.5ml的离心管中；

(3)4000g离心10min回收菌体，该步骤在4℃下进行；

(4)用1ml预冷的15％甘油重悬细胞沉淀；

(5)4℃以4000g离心10min后弃掉液体，回收菌体；

(6)重复步骤4、步骤5各一次；

(7)最后将菌体重悬于原体积1/10的10％甘油中，并分装至1.5ml离心管中，每管90μl，并冷冻保存，备用；

B、电击消除：

(1)将感受态细胞置于冰上融化后，加入10μl特殊电击缓冲液后混匀，并置于冰上放置10min；

(2)将感受态细胞全部转移至1mm的电击杯中，1.8KV/5ms电击一次；

(3)电击后立即加入1ml的SOC培养基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，0.05％(W/V)氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖)，37℃温育30min；

(4)将感受态细胞分别涂布至LBG平板和卡那霉素抗性平板中；

(5)将平板倒置后于37℃培养，24h后LBG平板和卡那霉素抗性平板均长出单菌落；

C、挑取质粒消除菌：

(1)用灭菌的牙签，将LBG平板上长出的菌落，分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养：

(2)将在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出，再分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养；

(3)挑出只在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落；

(4)挑出单菌落后，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消除；

3.如权利要求1所述的采用特殊的电击缓冲液，该电击缓冲液配方为：

KCl    0.5M

CaCl₂  0.15M

MgCl₂  0.25M

K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺这几种带正电荷配体，均可与带负电荷的细胞膜结合，从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来，可提高质粒消除率。