[发明专利]一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物遗传学相关领域。

技术背景

质粒是独立于染色体外具有独立复制能力的且对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA分子，普遍存在于细菌细胞内。由于在提取基因组时易受到质粒DNA的干扰，消除质粒后就能得到纯度较高的基因组，这对于研究细菌的遗传学和分子生物学有重要意义；同时，人们在研究带有质粒的菌株时，总希望得到相应的质粒消除菌，完全消除质粒的细菌与质粒存在的原始菌株比较，可以观察研究质粒的遗传学功能，完全消除质粒的细菌还可以作为基因工程菌，广泛应用于分子生物学研究。虽然某些质粒可自然丢失，但频率很低，仅为10^-2～10^-8，而绝大多数质粒需要借助物理、化学方法处理来提高质粒消除率。

目前，质粒消除的方法有化学处理法、物理法和高温处理法以及外源质粒替换消除法。常用的化学处理试剂有十二烷基硫酸钠、吖啶橙、溴化乙锭、库马霉素、新生霉素、利福平等提高质粒消除率。Hohn等利用吖啶橙来消除大肠杆菌细胞的F质粒，吖啶橙通过迅速抑制质粒的复制而达到质粒消除目的，但吖啶橙仅对大肠杆菌有效。库马霉素和新生霉素可抑制大肠杆菌细胞内的DNA回旋酶活性，而DNA回旋酶可催化超螺旋形成双链闭合环状的DNA，Novick等人报道利用库马霉素可有效地消除金黄色葡萄球菌青霉素酶质粒。Danilevskaya等人发现库马霉素对大肠杆菌来源质粒如pBR322、pMB9的消除均有较好效果；另外将温度提高5-7℃可达到消除质粒的目的，Carlton等将细胞在高温条件培养至对数期后期，再稀释后转接至新鲜的培养基中高温重新培养至对数期后期，经多次稀释高温培养，部分细胞的质粒消失。利用质粒的不相容性原理，将亲缘关系密切的质粒转化到细胞内，由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中，使得细胞在增值过程中将其中一个质粒丢失，也可达到消除目标质粒的目的。

还有一种新的方法即电击法，也可有效地消除质粒。当细胞处于电场中时，电位差达到某一临界值，细胞膜局部就会被击穿，形成瞬时的孔洞可以使质粒从细胞中排出，待电场消失后，损伤的细胞膜又可以自我修复。因此电击法可用于消除细菌中的质粒，同时，电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素，碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。电击法有比常规质粒消除法如溴化乙锭、高温培养法等处理法效果好，而且还有质粒消除率高、操作简单等优点。虽然国外有报道利用电击法消除大肠杆菌质粒，但是该报道并未考虑到电击缓冲液对质粒消除的作用，而且消除率比较低。本专利通过在电击前加入电击缓冲液，并采用优化的电击条件，提高了质粒消除率，而且准确率高，菌株更稳定。用电击结合特殊电击缓冲液的方法快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒，国内外还没未见相关报道。本专利提供的方法可快速有效地消除大肠杆菌看抗生素抗性质粒。

发明内容

针对目前现有的大肠杆菌消除质粒方法需要使用大量有毒的化学试剂如溴化乙锭、吖啶橙等，或者需要经过多次传代，才能够有效消除质粒，而且化学法和高温诱导法消除率均比较低。利用细胞处于电场中时，当电位差达到某一临界值，细胞膜局部被击穿，形成瞬时的孔洞，孔径大小可以使大分子质粒从细胞中排出，因此，电击法可用于消除细菌中的质粒。电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素，碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。

本发明的目的在于提供一种快速有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法。该方法经济有效、方便快速，而且消除率高。即

本发明提供一种将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法。

本发明提供一种特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除。

一种将人肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法，其步骤如下：

A、制备感受态细胞：