[发明专利]谷氨酸脱氢酶的一种提取方法

权利要求书

1.谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：以动物肝脏为原料提取获得谷氨酸脱氢酶粗酶液，依次经酸沉淀、硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附、透析、柱层析及冷冻干燥后获得谷氨酸脱氢酶成品。

2.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于动物肝脏包括猪、牛、羊、鸡等畜禽。

3.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于粗酶制备工艺为：称取定量动物新鲜肝脏，在高速组织捣碎机中捣碎10分钟(2000rmp)，加入0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心20分钟，收集上清液获得粗酶液，其中加入的磷酸缓冲液体积为动物肝脏的3～5倍。

4.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：酸沉淀工艺为：谷氨酸脱氢酶粗酶液用10％酸溶液调节pH，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH值7.6磷酸缓冲液溶解，其中10％的酸溶液可以为甲酸、乙酸、盐酸，pH值调节为4.5～4.8。

5.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：硫酸铵盐析工艺为：

第一次盐析：在室温下将酸沉淀定量样品慢慢加入固体(NH₄)₂SO₄到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。

第二次盐析：取29％(NH₄)₂SO₄盐析后的上清液定量，加固体(NH₄)₂SO₄到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中。

第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH₄)₂SO₄至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。

6.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：磷酸钙凝胶吸附工艺为：取定量49％硫酸铵盐析沉淀溶解液按比例加Ca₃(PO₄)₂凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液，其中硫酸铵盐析液同磷酸钙凝胶的比例为1∶0.25～1∶0.5(v/w)。

7.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：柱层析工艺为：磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液，浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，其中柱层析选用柱料为Sephadex G-150或Sephadex G-25。

8.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：制备获得的谷氨酸脱氢酶产品的比酶活高于7900U/mg，酶活回收率高于17％。