[发明专利]谷氨酸脱氢酶的一种提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及以动物肝脏为原料提取谷氨酸脱氢酶的一种方法。

背景技术

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)是一种催化使氨还原性地固定到α-酮戊二酸上形成谷氨酸反应的酶。它广泛分布于细菌、酵母、植物和哺乳动物组织中，其中动物肝脏内含量最高，该酶在氮素代谢中起着中心作用，对细胞内氨的固定或氢的转运起着重要的生物学作用，催化反应如下所示，可将氨固定形成谷氨酸，氨基被用于许多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脱氢酶已应用到医疗诊断中，此外，谷氨酸脱氢酶是制备尿素氮试剂盒(速率法)的必需酶之一。

国内研制尿素氮试剂盒所用的谷氨酸脱氢酶大多从国外进口，因此试剂盒的成本较高，为降低其成本必须解决谷氨酸脱氢酶的来源问题。国内有关谷氨酸脱氢酶的研究较少，医疗诊断用酶一直靠进口供给，因此，加强对谷氨酸脱氢酶的提取研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，依此法可以有效提高谷氨酸脱氢酶的回收率和产品纯度，降低生产成本，提高废弃物的利用率，减少环境污染。

谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，主要通过如下技术方案实现：

(1)粗酶液的制备

称取定量的动物新鲜肝脏，在高速组织捣碎机中捣碎10分钟(2000rmp)，加入0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心20分钟，收集上清液获得粗酶液。

(2)酸沉淀

所得粗酶液用10％酸溶液调节pH，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。

(3)(NH₄)₂SO₄盐析

第一次盐析：取定量上述酸沉淀溶解液，在室温下慢慢加入固体(NH₄)₂SO₄到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。

第二次盐析：取29％(NH₄)₂SO₄盐析后的上清液定量，加固体(NH₄)₂SO₄到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中。

第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH₄)₂SO₄至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。

(4)磷酸钙凝胶吸附

取定量49％(NH₄)₂SO₄盐析沉淀溶解液按比例加Ca₃(PO₄)₂凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液。

(5)柱层析

磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。

(6)谷氨酸脱氢酶的制备

柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活，计算酶活回收率。

本发明的优点：

(1)采用现代生物技术进行动物肝脏内谷氨酸脱氢酶提取工艺的开发：用硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附取代了传统工艺中大量酸碱溶液的使用，在降低污染实现绿色生产的同时产品的回收率可达到17％以上，产品比酶活达到7900U/mg以上，产品质量可达到国际同类产品水平。

(2)谷氨酸脱氢酶的制备工艺具有周期短、生产设备典型、操作工艺简单、成本低、效率高、产品纯度高等优点，在技术上处于国内领先水平。

(3)以动物肝脏为原料完成谷氨酸脱氢酶的制备，可实现资源的高效利用，减少废液排放，降低环境污染，从而实现谷氨酸脱氢酶的节约型生产。

附图说明

附图1是以动物肝脏为原料，经预处理、粗酶制备、酸沉淀、硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附、透析、柱层析、冷冻干燥获得谷氨酸脱氢酶成品的工艺流程图。谷氨酸脱氢酶的酶活回收率达到17％以上，产品比酶活高于7900U/mg，纯化倍数达到75倍以上。

具体实施方式