[发明专利]Tip60的pSer86单克隆抗体与制备方法和应用

权利要求书

1.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb，已于2011年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4940。

2.如权利要求1所述的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计1条Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列，将所述多肽序列与血蓝蛋白进行偶联形成一个多肽偶联蛋白，作为人工免疫原；所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列为：KTPTKNGLPGSRPG，其中Ser磷酸化修饰；

2)利用步骤1)所得人工免疫原对Bal b/C小鼠进行3～6次动物免疫后用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清免疫效价；

3)从血清免疫效价最好的小鼠身上获得脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0进行细胞融合，用酶联免疫吸附测定法经过2～6轮反复筛选杂交瘤细胞，最终获得能稳定分泌的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株也是Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体，由Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb产生的抗体。

4.如权利要求3所述的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，生产小鼠腹水并从其中获得抗Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体；

2)通过Protein G亲和层析柱分离纯化腹水后，获得纯化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。

5.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于酶联免疫吸附测定。

6.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫印迹检测。

7.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫共沉淀检测。

8.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫荧光染色检测。

9.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于检测细胞外源过表达磷酸化的Tip60；用于检测细胞内源表达磷酸化的Tip60。

10.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株和Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的鉴定方法：

1)利用合成的一个无磷酸化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列KTPTKNGLPGSRPG为对照物以及如前所述的一个在Tip60第86位丝氨酸有磷酸化的多肽序列进行酶联免疫吸附测定，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体只识别带有磷酸化的多肽序列，并不识别无磷酸化的Tip60多肽序列；

2)用构建的Tip60第86位丝氨酸突变成丙氨酸的突变体真核细胞表达载体pCMV-HA-Tip60 S86A来验证Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体能特异性地识别第86位丝氨酸磷酸化的Tip60，结果表明，所制备的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体，在免疫印迹中检测出外源过表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60；

3)采用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体通过应用免疫共沉淀和免疫印迹的方法对HCT116细胞进行检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体还能特异性地识别细胞内源表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60；

4)利用细胞转染过表达技术获得外源过表达的Tip60蛋白，用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行免疫共沉淀，最后用免疫印迹的方法进行检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫共沉淀；

5)利用细胞转染过表达技术和免疫荧光染色方法对外源过表达的Tip60蛋白进行免疫荧光染色，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫荧光检测。