[发明专利]一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法

权利要求书

1.一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

a、用羟乙基淀粉代浆液分离脐带血中有核细胞，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，脐带血单个核细胞用免疫磁珠阴性分离步骤去除非CD4细胞得到CD4+细胞，脐带血CD4+细胞进一步用免疫磁珠阳性分离步骤分离出CD25+细胞，获得富含调节性T细胞的脐血CD4+CD25+T细胞；

b、在细胞培养板或细胞培养袋中用连接CD3/CD28抗体的磁珠和重组人IL-2扩增富集的脐带血CD4+CD25+T细胞，获得高纯度的调节性T细胞；

c、将所述扩增后的调节性T细胞低温保存在液氮中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中分离得到脐带血单个核细胞的步骤包括：输血传播传染病检测合格的脐带血按体积比4:1的比例加入6%羟乙基淀粉代浆液，4℃冰箱放置沉淀红细胞，取上层血浆层离心，弃大部分血浆，沉淀的白细胞重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中扩增时间为2-3周，其中包括两轮各6-8天的扩增和两轮扩增中间细胞休息2-4天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中扩增后的调节性T细胞与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮-196℃保存。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的冷冻保护剂由10%二甲基亚砜，20%人白蛋白，70%羟乙基淀粉代浆液组成。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T细胞扩增后80-99%的细胞为CD4+CD25+T细胞，扩增后CD4+CD25+T细胞中FoxP3+CD127-细胞比例大于80%。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T细胞扩增后数量为起始细胞的1000-3000倍。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法扩增或低温保存后的调节性T细胞作为第三方无关供者细胞在制备治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病药物中的应用。