[发明专利]一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞体外扩增和保存方法，具体地说，是一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法。

背景技术

受体对MHC不匹配的移植物发生排斥反应是组织和细胞移植失败的主要原因。在目前临床实践中，传统免疫抑制药物的使用，虽能有效防止移植排斥，缓解由供者T细胞介导的急、慢性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），但常伴有受者整体免疫功能下降，感染机会增加和诱发肿瘤等副作用。因此，以诱导供受者之间移植免疫耐受为目的的细胞治疗方法日益受到重视。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）作为一种具有强大免疫抑制功能的T细胞亚群，被公认为免疫反应的主要负调节细胞，而基于Treg细胞的细胞疗法也被认为是最有希望成功的细胞疗法。Treg细胞可以通过多种方式调节免疫反应，包括分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β；大量消耗维持炎症细胞生存的细胞因子IL-2以及细胞表面的接触抑制。同时活化Treg可以发挥广谱的抑制效应，且这种抑制效应可以不受MHC分子限制。小鼠骨髓移植实验证明新鲜分离或体外扩增的小鼠Treg细胞能有效的抑制GVHD，这说明人Treg细胞也可能同样具有这样的治疗潜力。

然而，人Treg细胞的临床运用存在着许多问题和挑战。首先，机体内天然的Treg细胞数目很少，在人体内，Treg细胞占CD4+T细胞的5%～10%。这就需要建立有效的Treg细胞体外扩增方法，才能满足大量的临床输注需要。其次，与小鼠Treg不同，人Treg细胞不能单纯依靠CD25这一表面标志进行分离。一些Treg表达的标志，如：FoxP3、CTLA-4和GITR，也在某些活化效应T细胞上表达。所以，在分离人Treg细胞亚群时存在着巨大的困难，不能仅仅依靠上述这些标志进行分离。而相对的，来源于脐血的T细胞基本保持幼稚状态，T细胞亚群分布简单，存在明显的Treg细胞亚群，同时其含量也高于外周血。另外由于其含有相对较长的端粒，因而能够大量扩增。因此，脐血是Treg细胞的一个优质的来源。

尽管仍有许多问题尚待解决，但令人鼓舞的是，多个Treg细胞的临床I期实验正在进行，并且在近期取得了重要进展。美国和意大利血液病专家已完成了两项体外扩增脐血和外周血Treg细胞抑制GVHD的I期临床试验，证明经第三方无关供者Treg细胞治疗的病人其GVHD症状明显减轻，且没有出现感染、复发或早期死亡的情况。这明确了体外扩增的第三方无关供者脐带血Treg细胞在抑制GVHD上具有显著的临床效果，也有力的证实了脐带血Treg细胞的临床运用是安全的。有研究表明，脐带血Treg细胞经过体外扩增培养后其在体内外的抑制能力要比新鲜分离的Treg细胞更强，而且Treg细胞经过冻存和融化后仍然能发挥其有效的抑制功能。综上所述，对脐带血Treg细胞进行体外扩增并进行深低温保存，建立体外扩增的第三方无关供者人脐带血调节性T细胞冷冻保存库将极大地推动Treg细胞临床治疗造血干细胞移植移植物抗宿主病、同种异基因器官移植排斥、自身免疫性疾病的开展。

中国专利文献CN1509327B公开了一种来自人类血液的CD4CD25调节性T细胞，该发明提供抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+T细胞，用于增殖该细胞的方法，及抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+T细胞和增殖的T细胞作为调节性药剂的用途。但是关于一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法。

本发明的再一个目的是，提供一种所述的方法扩增后的调节性T细胞的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法，所述的方法包括以下步骤：

a、用羟乙基淀粉代浆液分离脐带血中有核细胞，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，脐带血单个核细胞用免疫磁珠阴性分离步骤去除非CD4细胞得到CD4+细胞，脐带血CD4+细胞进一步用免疫磁珠阳性分离步骤分离出CD25+细胞，获得富含调节性T细胞的脐血CD4+CD25+T细胞；

b、在细胞培养板或细胞培养袋中用连接CD3/CD28抗体的磁珠和重组人IL-2扩增富集的脐带血CD4+CD25+T细胞，获得高纯度的调节性T细胞；

c、将所述扩增后的调节性T细胞低温保存在液氮中。