[发明专利]高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法。

背景技术

桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的统称。广泛分布于亚洲、南美洲和欧洲的一些地区，全球种植面积达二千万多公顷。桉树品种多，包括杂交品种有700多种，在这些品种当中有些品种具有重要的经济价值，如可作为纸浆、木材、纤维板材以及提取单宁和精油等原材料。桉树具有速生，丰产，适应性强，生产周期短，收获后多发芽再生等优点。目前已被多个国家和地区广泛种植。桉树人工林面具约占世界人工林总面积的三分之一。因此桉树具有广泛的开发利用价值。

由于林木生长周期长，遗传杂合性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，传统的常规育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。因此人们希望利用新兴的基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育种是以现代分子生物学技术为基础，将目的基因通过体外重组导入受体细胞，然后再生出完整植株以培育出新品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，可以加速优质、高产、抗逆性强等桉树新品种的选育。

目前，桉树再生率低，实验材料主要以种子为基础，变异较大，很大程度上制约了桉树转基因技术的进展，完善的植物转化受体系统依赖于高效稳定的再生能力和稳定的外植体来源。对于广泛栽培的DH32-29等杂交优良无性系，实现转基因育种，筛选出优良的转基因株系，寻求高效稳定的再生率成为急需解决的技术难题。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，以便快速、高效、稳定地繁殖并选育优良品种。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，包括如下步骤：

培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；

愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0.01-0.1mg/L萘乙酸、10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织；

芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0.5-3.0mg/L亚精胺的B5培养基。

进一步地，培养无菌外植体步骤中，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗。

进一步地，腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是：温度22-30℃，无光照。

进一步地，丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-2.0mg/L细胞分裂素和0.01-1.0mg/L生长素的MS培养基，培养条件是：诱导培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。

进一步地，生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养基，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。

进一步地，白化苗培养子步骤中，采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基，培养条件是：暗培养14-35天，温度22-30℃。

进一步地，愈伤组织的诱导步骤中，外植体的切段长度为2-10mm，培养时温度22-30℃；弱光照培养时，光照12-18小时/天，光照强度20-200lx，22-30℃。

进一步地，芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述芽诱导分化培养基还含有0.2-2.0mg/L细胞分裂素，0.05-0.5mg/L生长素，培养条件是：光照12-18小时/天，光照强度500-3000lx，温度22-30℃。

进一步地，所述丛生芽培养子步骤以及芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述细胞分裂素为6-苄基嘌呤，生长素为萘乙酸；而生根苗培养子步骤中使用的生长素为3-吲哚丁酸。