[发明专利]麻疯树遗传转化苗的复壮及生根的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及麻疯树植物遗传转化技术领域，尤其涉及一种麻疯树遗传转化苗的复壮及生根的培养方法。

背景技术

麻疯树（Jatropha curcas），多年生木本油料植物，大戟科麻疯树属，原产美洲，广泛分布于热带亚热带地区。麻疯树耐干旱贫瘠，种子含油量高达60%，是目前重要的生物能源植物之一。

然而，目前麻风树存在种植区域狭窄，产量低等问题，而传统育种周期长，要获得一个优良性状且稳定遗传的品种需要8-10年。近年来，植物基因工程技术的快速发展，在许多粮食和经济作物的种质改良方面发挥了重要的作用。因此，成为改良麻风树抗逆性、提高产量、改善油质等性状的重要手段。

根癌农杆菌介导法是最常用的植物基因转化方法之一。根癌农杆菌含有Ti质粒，其上有一段T-DNA区。将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将目的基因插入到植物基因组中，通过减数分裂稳定地遗传给后代。

麻风树的研究工作起步较晚，关于麻疯树组织培养和遗传转化技术的报道还很少，且转化苗的生根率普遍较低。李美茹等研究人员以麻风树子叶作为外植体，草胺膦作为筛选剂，建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系，转化苗生根率为78%（Li M., Li H., Jiang H., et al. Transformation of an Agrobacterium-mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2008, 92(2): 173-181）。而Kumar等研究人员以麻风树叶片作为外植体，潮霉素作为筛选剂，建立的根癌农杆菌介导麻风树的遗传转化中，转化苗的生根率只有40%（Kumar N., Anand K.G.V., Pamidimarri D.V.N.S. et al. Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer using leaf explants. Industrial Crops and Products, 32: 41–47）。Pan 等研究人员以麻风树叶片作为外植体，卡那霉素作为筛选剂，利用农杆菌介导法对麻风树进行转化中，获得的120株再生植株只有1株生根（Pan J., Fu Q., Xu F. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of biofuel plant Jatropha curcas using kanamycin selection. African Journal of Biotechnology, 9(39), 6477-6481）。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种麻疯树遗传转化苗的复壮及生根的培养方法，以明显改善麻疯树遗传转化苗纤弱的生长状态，提高生根率。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种麻疯树遗传转化苗的复壮及生根的培养方法，包括如下步骤：

准备步骤，选用合适的外植体由根癌农杆菌浸染处理后，再经抗性愈伤诱导及分化培养基培养后获得再生芽作为抗性芽备用；

壮苗培养步骤，将抗性芽从抗性愈伤组织上切取下来，切去褐化部位，转接到壮苗培养基P中进行壮苗培养；

生根培养步骤，挑取经过壮苗培养后高2-3厘米并有4-6片叶的抗性芽，切除基部愈伤组织，用10-20mg/L的生根粉溶液浸泡8~15分钟，转接至生根培养基R中进行生根培养，直至生根苗达到出罐炼苗的技术要求；

炼苗步骤，对达到出罐炼苗的技术要求的生根苗开盖炼苗，移栽至温室。

进一步地，准备步骤中选用的外植体为带有4-6片真叶的茎段，其长度为2-3cm。

进一步地，所述准备步骤中使用的根癌农杆菌是如下携带含有目的基因载体的根癌农杆菌菌株中的任意一种：EHA105、LBA4404、GV3101、MP90。

进一步地，所述准备步骤中使用的抗性愈伤诱导及分化培养基含有1-3 mg/L草胺膦或20-50 mg/L卡那霉素或1-10 mg/L潮霉素。