[发明专利]一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于由微生物液态发酵生产黑色素技术领域，具体利用环境胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法。

背景技术

黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，它是通过多羟基酚(极易结合蛋白)氧化而形成结构不规则的非均质的类多酚聚合体。黑色素在工农业上，可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、阳离子螯和剂、作为无定形的半导体以及生物杀虫剂的光保护剂；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病、一些可溶性黑色素在体外具有抑制爱滋病病毒感染宿主细胞的作用，因此有可能成为一种有效的药物.目前黑色素的生产多是通过化学合成或从动、植物体进行提取。化学合成黑色素反应过程多，且具有一定的毒害性；从动、植物体提取黑色素存在样品来源的问题。利用微生物生产黑色素具有反应条件温和、成本低、操作简单、无需大量的样品等优点。而国内利用真菌发酵生产黑色素的研究还很少，而本发明是利用环境胁迫提高出芽短梗霉黑色素的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一株产黑色素的出芽短梗霉菌(Aureobasidium Pullulans)，并采用改良培养基对其深层液态发酵提供黑色素产量的方法。

一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法，其特征在于：先将保藏编号为CGMCC3337的出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans)菌株活化后摇瓶培养，按照1～10％接种量接种于发酵培养基，进行液态发酵。发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50％的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用1mol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。

本发明采用的的实施步骤如下：

(1)菌种活化：将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在22～28℃下恒温培养4～8小时，得到活化菌株；

(2)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L)：葡萄糖20～40，土豆汁100～700，牛肉膏1～5，蒸馏水，pH 4～7，121℃灭菌20min；从斜面上挑取一环出芽短梗霉菌接入上面的种子培养基中摇瓶培养，培养12h～36h，培养温度：27±2℃，转速为150～230rpm。

(3)发酵培养基：现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：葡萄糖40，土豆汁：400，牛肉膏：1，FeSO₄ 0.02，蒸馏水，121℃灭菌20min；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)：葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1，FeSO₄0.02，H₂O₂5mmoL/L～25mmoL/L，蒸馏水，pH 4，121℃灭菌20min。

(4)将种子液接种于10L自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为1％～10％(V/V)，发酵搅拌速度为200～500r/min，发酵温度为25℃，通气量为0.5～1(V/V)，罐压为0.01～0.02Mpa，pH 4.0～7.0，分别发酵3～5天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50％的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用1mol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。

所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。