[发明专利]一种鸡IL-18与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)与新城疫病毒HN融合蛋白及编码该融合蛋白的DNA序列以及含该DNA序列的载体和酵母菌，还涉及重组融合蛋白及其应用，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗和免疫佐剂的技术领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)被国际兽疫局列为对动物危害最大的A类传染病之一，它是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽类的一种以呼吸困难、拉黄绿色稀便、神经机能紊乱和粘膜、浆膜出血为主要特征的高度接触性、急性败血性传染病；给养禽业造成了巨大经济损失。鸡新城疫由于其发病率和死亡率都很高，是威胁养鸡业的头号疾病，对该病的控制成功与否直接决定了养禽业的发展趋势。NDV的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因编码的HN蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用，是NDV除F糖蛋白之外另一种较大的糖蛋白，也是病毒的主要宿主保护性抗原，可诱导机体产生中和性抗体，在机体抗感染免疫中起着重要作用。因此，HN基因是NDV基因工程疫苗研究中的首选基因之一，用基因工程表达的HN蛋白具有良好的免疫原性，免疫鸡后能产生较高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。

在鸡新城疫免疫预防中常规使用的疫苗主要有各种不同毒力的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗。但传统新城疫灭活疫苗的共同特性是能诱导强烈的体液免疫应答，而细胞免疫反应则相对软弱。在新城疫的抗感染免疫中，抗体反应对于机体抵抗病毒的感染是必需的，但不能阻止病毒的传播。因而，近年来随着分子生物学技术的飞速发展，NDV基因工程疫苗的研制已成为人们研究的热点，但基因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，动物保护实验效果不够理想。因此，研究者试图从多方面增强NDV疫苗的免疫效果，其中用细胞因子作为分子免疫佐剂，已引起研究者的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好免疫效果的chIL-18-HN融合蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种编码该融合蛋白的DNA序列。

本发明的第三个目的是提供一种含该DNA序列的载体以及宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供一种以毕赤酵母菌为宿主细胞的基因工程chIL-18-HN融合蛋白的制备方法。

另外，本发明的目的还在于提供一种该融合蛋白在鸡新城疫防治中的应用方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种chIL-18-HN融合蛋白，包括鸡白细胞介素18(chIL-18)的氨基酸序列、新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN蛋白)的氨基酸序列以及位于chIL-18氨基酸序列和新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列之间的柔性Linker肽氨基酸序列；由chIL-18基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker肽(-G-G-S-G-G-S-G-G)串联连接而成。

所述chIL-18-HN融合蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

所述的柔性Linker肽具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

同时，本发明的技术方案还采用了一种分离的DNA序列，编码具有序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的融合蛋白。

该DNA序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

本发明的技术方案还采用了一种重组毕赤酵母载体和宿主细胞，它含有具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA序列。

重组融合蛋白在鸡新城疫预防和治疗中的应用。

具体地：本发明的chIL-18-HN融合蛋白及其DNA序列如下：

chIL-18-HN融合蛋白基因是由鸡IL-18基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker基因串联连接而成，该串联DNA序列所编码的氨基酸序列即为chIL-18-HN融合蛋白。一方面，新城疫病毒HN蛋白能诱导机体产生高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。同时，IL-18能诱导IFN-γ产生，刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化，增强Th、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等活性的功能，能特异性增强机体诱导细胞免疫和体液免疫的能力，在宿主防御、抗感染免疫等方面具有重要作用。二者通过柔性氨基酸肽连接，在保持独立的空间结构的同时能有效发挥各自的生物学功能。

本发明还采用了一种能高效表达chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌的构建方法：