[发明专利]马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。

背景技术

马病毒性动脉炎(Equine Viral Ateritis，EVA)是一种由马病动脉炎病毒(Equine Ateritis Virus，EAV)引起，在马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病。马匹感染EAV后大部分呈亚临床感染，一部分成年马的流感样症状、怀孕母马发生流产，新生马驹发生间质性肺炎。约有30％-60％种公马感染EAV后持续带毒，精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病在临疹上表现为发热、白细胞减少，常伴有眼睑水肿和四肢浮肿，其特征性病理变化为小动脉内膜变性和坏死。

本病主要以美洲和欧洲为中心呈世界性分布，以小规模或中等规模的流行形式反复发生。澳大利亚虽然没有临床症状发生，但是通过对保存血清的检查表明，1975年澳大利亚就有EAV抗体阳性马。对1989-1992年收集的马血清检查结果表明，南非也有抗体阳性马。1996年日本发现EAV抗体阳性的赛马。1996年我国出口韩国的马匹中也发现了EAV抗体阳性马，但至今没有从马匹中分离到EAV。

近年来，由于赛马业的发展和国外对食用马的需求，进出口马病的检测量不断增加。国内外研究者开发了多项马病快速检测诊断方法，如山东检验检疫局马病实验室研究的ELISA、PCR检测马鼻肺炎和马动脉炎，固相基因芯片技术检测五种马病等这些方法基本上实现了快速检测的需要。但是有些病还没有成熟的检测技术及试剂，如锥虫病、焦虫病等还需要用进口检测试剂。进口试剂和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货，会严重影响检测进程。此外，现有的快速检测方法中，ELISA、PCR等技术通量小，费时费力；固相芯片技术可以实现高通量检测，但成本特别昂贵，无法在马病检测中应用。迫切需要一种高通量、低成本、快速特异、灵敏可靠检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的马动脉炎病毒液相芯片检测方法，及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。

本发明为实现上述目的，采用液相芯片技术。该技术是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是将编码微球单个逐一通过检测通道时受到双色激光(如红色和绿色)同时照射，第一束激光激发微球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比例也不同，从而将不同的特异性反应区分开来；第二束激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量从而确定目标分子的数量(定量)。系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号，不记录未结合的报告分子荧光信号，因此检测前无需洗脱未结合的报告分子。此外，利用流式细胞术中90℃角散射光可有效地消除微球聚集对结果造成的影响。各种荧光信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。

本发明中所涉及到的引物和探针序列如下：

正向引物dirct primer：5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3` SEQ ID NO：1

反向引物reverse pr imer：5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3`SEQ ID NO：2

探针Probe：5`-CGGCGGCGACAGCCTACA-3`SEQ ID NO：3。

正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。

本发明的引物和探针用于检测马动脉炎病毒，其检测方法包括有：1)检测样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和5)液相芯片仪分析步骤。

其中步骤2)RT-PCR反应的循环条件为：

第一阶段，反转录50℃：30min；

第二阶段，预变性94℃：3min；

第三阶段，扩增94℃：30s，59℃：30s，72℃：30s，30个循环；

第四阶段，延伸72℃：5min。