[发明专利]制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体及其构建方法

权利要求书

1.一种制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于：在E1区携带报告基因表达元件，将该表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与3326bp之间；在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处引入两个单一的酶切位点，在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列。

2.按照权利要求1所述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于：所说的携带的报告基因是绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶、红色荧光蛋白中的任意一种。

3.按照权利要求1所述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于：所说的在腺病毒六联体蛋白的高可变区5分别引入两个单一的酶切位点是是BamHI、SfuI、SwaI中任意两种。

4.按照权利要求1所述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于：在Ad5载体的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶基因表达元件，在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素筛选基因中的任意一种。

5.按照权利要求1所述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于：所说的在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入的小肽序列是Tat PTD、RGD、SIKVAV、NGR、RVG16、RVG29中的任意一种；

上述的Tat PTD的序列为：GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAG

ACCACAAGG，RGD的序列为：GATCTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCGG，

SIKVAV的序列为：GATCTTGTGACTGCAGTATTAAAGTTGCAGTCTGTTTCTGCGG，

NGR的序列为GATCTTGTGACTGCAACGGACGCTGTTTCTGCGG，RVG 16的序列为：

GATCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACGG，

RVG29的序列为：GATCTTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACAC

CTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGTT。

6.一种权利要求1制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：

(1)构建在E1区携带报告基因表达框的腺病毒质粒载体

用聚合酶链式反应获得报告基因，将该片段克隆到腺病毒E1穿梭载体中，获得的阳性质粒载体命名为pAd5CMV-Reporter-SV40pA-shuttle，将ScaI线性化的载体pAd5CMV-Reporter-SV40pA-shuttle与ClaI线性化的载体pTG3602共转化BJ5183，经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在E1区携带CMV-Reporter-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV-Reporter；

(2)构建引入单一酶切位点1的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列上游800bp同源臂的质粒载体

以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入单一酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列的上游800bp的DNA片段，设计聚合酶链式反应的引物，通过聚合酶链式反应，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点1的腺病毒六联体蛋白的高可变区5序列上游800bp同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/Hexon HR up-single enzyme1；

(3)构建引入单一酶切位点2的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体

以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入单一酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列，设计聚合酶链式反应的引物，通过聚合酶链式反应，聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，阳性克隆为引入单一酶切位点2的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/Hexon HR down-single enzyme2；

(4)构建腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携带筛选基因的穿梭载体

将合成的带有EcoRI-XbaI-BamHI-SfuI-ClaI-HindIII酶切位点的DNA序列，其DNA序列如下：AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA连入经EcoRI和HindIII双酶切的pUC19质粒载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19EHL；

将Hexon HR up片段从pGEMT/Hexon HR up-single enzyme1载体上经XbaI和单一酶切位点1对应的内切酶双酶切下来，经1％的琼脂糖凝胶电泳回收后连入经相同酶双酶切的pUC19EHL中，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Hexon-up HR，将Hexon HR down片段从pGEMT/Hexon HR down-singleenzyme2载体上经BamHI和ClaI双酶切下来，经1％琼脂糖凝胶电泳回收后连入经相同酶双酶切的pshuttle-Hexon-up HR载体中，经碱性裂解法提取质粒DNA、酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pshuttle-Hexon-up-down HR；将经过单一酶切位点1和2所对应的内切酶双酶切的筛选表达元件连入经过相同酶双酶切的pshuttle-Hexon-up-down HR载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携带筛选基因的穿梭载体，命名为pshuttle-Hexon-screening gene；

(5)构建六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体

将pshuttle-Hexon-screening gene经XbaI和ClaI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳回收Hexon-screening gene片段后与经BamHI线性化的pAd5CMV-Reporter共转化Bj5183感受态细胞，培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，命名为pRGHMAd5；

(6)六联体蛋白经小肽修饰的腺病毒的载体的构建及病毒制备

将合成的小肽的寡核苷酸退火后与经单一酶切位点1和2酶切处理后的pRGFMAd5连接，连接产物转化、培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切及测序鉴定获得阳性克隆为六联体蛋白经小肽修饰的腺病毒的载体，命名为pRGFMAd5-小肽，将pRGFMAd5-小肽载体经PacI线性化后转染HEK293细胞，7-10天后获得病毒原液，经过扩增，通过CsCl梯度离心纯化后获得六联体蛋白经小肽遗传修饰的腺病毒，命名为Ad5-Hexon-small-peptide。