[发明专利]制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种用于快速制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒的载体在基因治疗中具有广阔的应用前景，是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一。腺病毒的衣壳蛋白主要有三种，分别为Hexon，Penton base和fiber。腺病毒侵染细胞的过程如下：

首先，腺病毒的衣壳蛋白Fiber中Knob结构域与靶细胞表面的特异性的CAR受体结合，完成腺病毒对靶细胞的黏附过程；然后，腺病毒五邻体蛋白Penton base的RGD肽段与靶细胞表面αvβ3或αvβ5整合素结合，通过内吞作用将病毒内化至细胞后，病毒基因转运至细胞核，进而进行病毒基因的转录和表达。六联体蛋白(Hexon)是腺病毒衣壳蛋白中最为丰富的蛋白，其结构暴露于腺病毒表面，是宿主免疫原性的主要靶点。腺病毒在肿瘤基因治疗中有着广泛的应用，但是大多数肿瘤组织细胞表面CAR表达水平低、甚至不表达，这严重影响了上述两个步骤的进行，使腺病毒对靶细胞的感染效率大大降低。

六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体，可以解决对靶细胞感染效率低的问题，但目前，已有的载体没有能够用于连接小肽的合适的酶切位点，没有用于筛选的报告基因，并且构建六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体的方法比较复杂，比如通过同源重组的方法进行修饰，这些构建方法制备周期长，体外连接小肽的效率低，成本高，筛选阳性克隆的手段条件繁琐。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服目前制备六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体的方法的缺点，提供一种制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种简单、快速的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法。

解决上述技术问题采用的技术方案是：在E1区携带报告基因表达元件，将该表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与3326bp之间；在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处分别引入两个单一的酶切位点，在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列。

本发明的携带的报告基因是绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶、红色荧光蛋白中的任意一种。

本发明的在腺病毒六联体蛋白的高可变区5分别引入两个单一的酶切位点是BamHI、SfuI、SwaI中任意两种。

本发明的在Ad5载体的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶基因表达元件，在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素筛选基因中的任意一种。

本发明的在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列是Tat PTD、RGD、SIKVAV、NGR、RVG16、RVG29中的任意一种。

上述的Tat PTD的序列为：GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAG

ACCACAAGG，RGD的序列为：GATCTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCGG，

SIKVAV的序列为：GATCTTGTGACTGCAGTATTAAAGTTGCAGTCTGTTTCTGCGG，

NGR的序列为GATCTTGTGACTGCAACGGACGCTGTTTCTGCGG，RVG 16的序列为：

GATCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACGG，

RVG29的序列为：GATCTTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACAC

CTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGTT。

上述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法由下述步骤组成：

1、构建在E1区携带报告基因表达框的腺病毒质粒载体