[发明专利]一种高产延胡索酸米根霉及其应用

权利要求书

1.一种高产延胡索酸米根霉(Rhizopus delemar)，其特征在于过量表达酿酒酵母丙酮酸羧化酶基因。

2.根据权利要求1所述米根霉的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)根据米根霉(R.delemar)胞内蛋白的表达与启动子直接相关，而与拷贝数无关，以NCBI公布的Rhizopus oryzae AF282846、AF282847序列设计两对引物分别扩增丙酮酸脱羧酶基因的启动子与终止子片段；

2)以NCBI公布的NM_001180927.1序列，采用化学全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因编码区；

3)将步骤1)和2)得到的三段片段进行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表达框；

4)将步骤3)获得的表达框克隆到pRS303H载体，转化米根霉悬浮孢子后得到重组菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述转化在1000V～10000V的电场强度下进行。

4.权利要求1所述米根霉应用于延胡索酸的生产，其特征在于采用所述米根霉为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养5-7天，至分生孢子成熟；无菌水洗下孢子，稀释到106个/mL；以4％的体积比转接孢子悬浮液至种子培养基，30℃，200rpm培养30h；以10％的体积比转接前培养种子至发酵培养基，30℃，200rpm培养72h。

5.根据权利要求书4所述的应用，其特征是种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白胨6，碳酸钙6。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 0.3，MgSO4 7H20 0.4，ZnSO4 7H2O 0.044，FeSO4 7H2O 0.01，CaCO3 80，灭菌后加甲醇15mL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述米根霉在葡萄糖为唯一碳源，培养72h，延胡索酸产量达到55.92g/L。