[发明专利]一种高产延胡索酸米根霉及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产延胡索酸米根霉，特别是一种通过代谢工程手段过量表达ScPYC1基因提高胞内丙酮酸羧化酶活性来强化三羧酸循环的回补途径，从而调控碳代谢流从丙酮酸进入TCA还原途径，实现延胡索酸过量积累的方法。

背景技术

延胡索酸(fumaric acid)是一种重要的二元羧酸，广泛用于树酯合成、食品添加剂、饲料添加剂、医药、航空材料等工业生产中。米根霉(Rhizopus delemar)作为大量积累延胡索酸的主要微生物之一，广泛用于有机酸、酶、抗体、低胆固醇的生产。R.delemar胞内存在TCA氧化途径及胞液中TCA还原途径。丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下，与CO₂相互作用形成草酰乙酸。同时，作为TCA氧化途径中间代谢产物的草酰乙酸，在菌体生长过程中作为前体物质用于菌体物质的合成。当微生物生长环境中氮源成为菌体生长的限制条件时，菌体停止生长，葡萄糖代谢过程中的CO₂固定途径仍然继续作用，此时C₄化合物积累。在非菌体生长时期，1mol葡萄糖分解代谢，在丙酮酸羧化酶作用下固定2mol CO₂，形成2mol延胡索酸。然而，如果米根霉菌体代谢只有TCA还原途径，则无法合成供物质运输及维持机体正常生理代谢的ATP，因此，延胡索酸合成过程伴随着TCA氧化途径。此外，研究表明米根霉新陈代谢，碳代谢流从丙酮酸节点流向TCA氧化途径的代谢通量远超过流向TCA还原途径。因此，通过分子改造或者改变培养条件调节碳代谢流向过量积累延胡索酸成为众多研究者探讨的热点。但是，针对米根霉的基因操作技术及遗传改造技术相对薄弱，且米根霉是多核细胞，重组细胞有丝分裂不稳定。因此，针对米根霉外源基因的表达直到近10年才有一点突破，而碳代谢流的细节至今仍不明确。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种高产延胡索酸米根霉，通过过量表达丙酮酸羧化酶基因，强化胞液中TCA还原途径，增强丙酮酸节点流向胞液中TCA还原途径的碳代谢通量，实现延胡索酸过量积累的方法。

所述米根霉(R.delemar)过量表达外源丙酮酸羧化酶基因。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种获得所述米根霉的方法，具体步骤如下：

1)根据米根霉(R.delemar)胞内蛋白的表达与启动子直接相关，而与拷贝数无关，以NCBI公布的Rhizopus oryzae AF282846、AF282847序列设计两对引物分别扩增丙酮酸脱羧酶基因的启动子与终止子片段；

2)以NCBI公布的NM_001180927.1)序列，采用化学全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因编码区；

3)将步骤1)和2)得到的三段片段进行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表达框；

4)将步骤3)获得的表达框克隆到pRS303H载体，转化米根霉悬浮孢子后得到重组菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述米根霉发酵生产延胡索酸的方法，以米根霉为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养5-7天，至分生孢子成熟；无菌水洗下孢子，稀释到10⁶个/mL；以4％的体积比转接孢子悬浮液至种子培养基，30℃，200rpm培养30h；以10％的体积比转接前培养种子至发酵培养基，30℃，200rpm培养72h。

产孢子培养基：PDA培养基。

种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白胨6，碳酸钙6。

发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，(NH₄)₂SO₄ 2，KH₂PO₄ 0.3，MgSO₄·7H₂0 0.4，ZnSO₄·7H₂O 0.044，FeSO₄·7H₂O 0.01，CaCO₃ 80，灭菌后加甲醇15mL。

细胞干重测定：基于延胡索酸钙的低溶解度，发酵液沸水浴至澄清后，添加去离子水至无晶体析出，取发酵液20mL，8000g离心10min收集菌丝体。然后用去离子水冲洗菌丝体3遍，105℃过夜烘干至菌丝体质量恒定，测定菌体质量。

葡萄糖、延胡索酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Aglient1200高效液相色谱仪