[发明专利]一种含有D型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法有效
申请号: | 201110428826.4 | 申请日: | 2011-12-19 |
公开(公告)号: | CN102517241A | 公开(公告)日: | 2012-06-27 |
发明(设计)人: | 刘智志;杨欣;陈依军 | 申请(专利权)人: | 中国药科大学 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12N9/02;C12N15/63;C12R1/19 |
代理公司: | 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 | 代理人: | 陶海锋 |
地址: | 210009 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 含有 氨基酸 羰基 还原酶 突变体 制备 方法 | ||
1.一种大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,所述大肠杆菌原核表达系统含有带有p15A复制子的pAC-ph△-AK3质粒和带有ColE1复制子的pETDuet-T2DK-DKR质粒。
2. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,pAC-ph△-AK3质粒由pACYC184改造得到:pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列,1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列。
3. 根据权利要求2所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,pAC-ph△-AK3质粒具有SEQ ID No.1 所述核苷酸序列。
4. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于pETDuet-T2DK-DKR由质粒pETDuet-1 改造得到:在第一个多克隆位点引入了双羰基还原酶突变体的序列,106位到143位替换成了双羰基还原酶突变体的序列,第二个多克隆位点引入了ph氨酰tRNA合成酶的序列,298位到354位序列替换成为ph氨酰tRNA合成酶的序列。
5. 根据权利要求4所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,pETDuet-T2DK-DKR质粒具有SEQ ID No.2 所述核苷酸序列。
6. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
7. 根据权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统,其特征在于,所述大肠杆菌原核表达系统由pAC-ph△-AK3质粒和pETDuet-T2DK-DKR质粒共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞得到。
8. 利用权利要求1所述肠杆菌原核表达系统制备含有D型赖氨酸的双羰基还原酶突变体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 在培养基中添加D型赖氨酸,异丙基硫代半乳糖苷诱导权利要求1所述大肠杆菌原核表达系统表达,高压破碎,离心取上清;
(2) 采用亲和层析和阴离子交换层析结合的方法纯化上清液得到含D型氨基酸的双羰基还原酶。
9. 一种在目的蛋白中引入D型赖氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 在表达性质粒的特定酶切多克隆位点引入了目的蛋白的表达基因,并且将所述表达基因的目的位点突变成为TAG密码子;在该表达性质粒的另一个特定酶切多克隆位点引入ph氨酰tRNA合成酶的序列,得到重组质粒;将pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列,1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列,得到pAC-ph△-AK3质粒;由pAC-ph△-AK3质粒和重组质粒共转染到宿主中,得到表达系统;
(2) 在培养基中添加D型赖氨酸,诱导上述表达系统表达目的蛋白,纯化得到目的蛋白。
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