[发明专利]一种含有D型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备含有D型氨基酸的蛋白质和/或多肽的方法。

背景技术

在蛋白质和多肽中引入非天然氨基酸使其获得新的性质是一种已经广泛运用于蛋白质多肽类药物修饰和制备生物材料等领域的策略。现今能够在蛋白质多肽中引入非天然氨基酸的方法主要包括3种： 

(1) 多肽固相合成法。Merrifield首先采用的多肽固相分步合成方法将D型氨基酸与精氨酸类似物引入到促黄体素释放素中（参见：Science. 1965; 150:178-85.）。该方法能在小于100个残基的多肽中任意位置引入非天然氨基酸。但是具有仅限于合成小于100个氨基酸残基的短肽和需要繁琐的保护和去保护等步骤等缺点。

(2) 体外蛋白质翻译。Larisa M等利用S30体外蛋白质翻译系统在二氢叶酸还原酶和荧光素酶中成功引入D-Met and D-Phe（参见：J. Am. Chem. Soc. 2003 ; 125:6616-7.）。但是该方法具有效率低、成本高和不能放大等缺点。

(3) 遗传密码扩充方法。Schultz 等人通过在活细胞中定向进化外源的tRNA和氨酰tRNA合成酶分子对，将一系列的L型非天然氨基酸通过活细胞的核糖体蛋白合成系统引入到蛋白质中（参见：Science. 2001;292:498-500.）。通过该非天然氨基酸引入技术获得了一系列具有新性质的蛋白质已经广泛的应用于相关领域，如：1. 在蛋白中引入带荧光氨基酸用于细胞内相关蛋白定位；2.引入带酮基团的非天然氨基酸用于点击化学的研究；3. 引入含酮基和叠氮基团的非天然氨基酸用于蛋白质多肽药物的定点修饰。4. 引入带乙酰、甲基等非天然氨基酸用于模拟细胞内乙酰化和甲基化等翻译后修饰。

虽然遗传密码扩充技术能定点在任意大小的蛋白中引入100多种L型非天然氨基酸，相比前人的技术有重大的突破，但是该技术还是不能满足人们希望通过改变氨基酸手性来定点修饰和改造蛋白质和多肽的要求。因此，开发一种有效地在任意大小的蛋白中引入D型氨基酸的方法为定点修饰蛋白质和多肽类药物、研究老年疾病的病理、制备新型的生物材料和定点修饰改变蛋白质的空间结构等领域均具有重大意义。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种大肠杆菌原核表达系统，利用该大肠杆菌原核表达系统可在双羰基还原酶的任意位点引入D型赖氨酸，为制备含D型赖氨酸的多肽和/或蛋白质提供了新的方法。

本发明的原理为：通过在大肠杆菌细胞中表达一对来源于Pyrococcus horikoshii的赖氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA的分子对，通过氯霉素抑制实验和蛋白质水解及手性高效液相分析等方法证明了该分子对在含D型赖氨酸培养基中对D型赖氨酸的偏好，并利用这种偏好性在双羰基还原酶的非活性位点定点引入了D型赖氨酸，引入效率接近100%。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种大肠杆菌原核表达系统，所述大肠杆菌原核表达系统含有带有p15A复制子的pAC-ph△-AK3质粒和带有ColE1复制子的pETDuet-T2^DK-DKR质粒。

上述技术方案中，pAC-ph△-AK3质粒由pACYC184改造得到：pACYC184的2920位到3542位序列替换成ph氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替换成3个抑制性tRNA序列。pAC-ph△-AK3能编码来源于Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA分子对，其中赖氨酰tRNA合成酶由谷氨酰胺tRNA合成酶启动子和终止子调控表达，抑制型tRNA由lpp启动子和rrnC终止子调控表达；除此之外，氯霉素乙酰转移酶的112位天冬氨酸密码子突变成为琥珀密码子TAG以检测Pyrococcus horikoshii 的赖氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对的表达情况。具体地，pAC-ph△-AK3质粒具有SEQ ID No.1 所述核苷酸序列。