[发明专利]一种克服葡萄糖及乳酸抑制的透明质酸发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别是一种克服葡萄糖及乳酸抑制的透明质酸发酵方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)，又名玻璃酸，其分子量在几十万到几百万之间，由于结构上的特点，决定它具有比较特殊的物理化学性质，其水溶液有着良好的粘弹性和流变性，在食品，化妆和医用方面都有应用。不同用途的HA对分子量有不同要求，小分子量的HA多用于保健品中，中等分子量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA可用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中具有很高的应用价值。因此HA的生产中，高分子量和高产率依然是研究的主要目标。

近年来我国HA组织提取法研究已趋于成熟。但原料紧缺，工艺复杂，成本高，无法满足国内市场需要。目前透明质酸已由传统的动物器官提取法转为微生物发酵法生产，微生物发酵法是制备HA的主要方法，国外对发酵法研究较早，技术也日见成熟，但因生产厂家少，世界需求仍然缺口大；近年来我国不少学者虽积极进行这方面的研究，但由于在菌种选育、发酵工艺和提取纯化等方面的难题，使我国在这方面的研究进展缓慢。我国应加快发酵法生产透明质酸的步伐，关键是在提高产率，提高产品分子量和分离纯化的技术方面进行攻关，赶上世界先进水平，以减少进口量。

在兽疫链球菌发酵过程中，透明质酸的产量在一定范围内随着底物浓度的增加而增加，若底物浓度过高，对透明质酸的生产有抑制作用，得到的透明质酸相对分子质量也较小。而且在产生HA的同时还会有乳酸生成，对菌体的生长和HA的产生都有抑制作用，在此发明中，针对发酵底物的不同和生成产物的多少，研究底物和产物对透明质酸生产的抑制作用，并指出解除抑制的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种克服葡萄糖及乳酸抑制的透明质酸发酵方法。

为达到上述目的，本发明的方案为：

透明质酸的发酵工艺，以兽疫链球菌为种子，包括一级种培养，二级种培养及发酵培养，各过程培养基重量配方如下表：

所述一级种培养是从斜面试管转种到锥形瓶中进行，培养温度33℃～37℃，培养时间18～24小时；

所述二级种培养的步骤为：首先配制二级种子培养基，按照重量8％～12％的接种量接入一级种子进行培养，培养温度33℃～37℃，培养时间20～24小时，OD₆₆₀值增加到0.8～1.2时接入发酵液中；

所述发酵培养的步骤为：首先配制发酵培养基，按照重量5％～10％的接种量接入二级种子进行培养，发酵温度33℃～37℃，发酵周期30～35小时。

本发明的有益效果是：提高了透明质酸的产量，增大了透明质酸的分子量；解除底物和产物的抑制作用，本发明不仅可提高透明质酸的产量，而且得到的透明质酸的分子量大。

具体实施方式

本发明在具体实施时应注重以下技术要点：

1.制备的斜面必须适合菌体生长及其保存，不能太软、太湿，或太硬，斜面出现干裂则不能使用。每代新斜面保藏于冰箱4℃，一般不应超过3～4周，时间过长，使活菌数减少，影响透明质酸产量。斜面的传代数不应超过第六代，过多的传代诱使菌种退化，应避免。

2.从斜面到二级种培养，斜面应在使用期内，转移量要适当，不能太少，否则种子生长缓慢或不长，应保证二级种菌浓度OD₆₆₀在0.8左右。

3.从二级种培养到发酵培养，接种量为5％～10％(重量)，发酵期间搅拌的转数不能过大，否则因剪切力过大使产物分子量下降。

4.(NH₄)₂SO₄配成20％(重量)的水溶液，葡萄糖配成50％(重量)的水溶液，另于112℃20min消毒后补加，葡萄糖和硫酸铵都为透明质酸合成提供必需的原料。

5.在发酵开始时主要是要求菌体的快速生长，再发酵生产透明质酸，所以要求初糖浓度较低，应分批补料方式加入葡萄糖，促进碳源转化为HA。

6.发酵温度过高，可加快菌体生长的速度，但不利于合成大分子的透明质酸。

7.发酵过程中，在菌体进入对数生长前期，pH的控制不宜高于8.0，而在对数生长中后期，pH不宜低于8.0，当加入硫酸铵、葡萄糖后，pH应在8.0～8.5间，直至发酵结束，pH在8.0～8.5时，有利于透明质酸生物合成。