[发明专利]高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是涉及一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Pravej Alam等在2011年的《Plant Cell Rep》(《植物细胞报道》)发表了题为“Over-expression of HMG-CoA reductase and amorpha-4，11-dienesynthase genes in Artemisia annua L.and its influence on artemisinin content”(“在青蒿中过表达HMGR和ADS基因对青蒿素含量的影响”)的论文，报道通过共同转化青蒿素合成途径关键酶基因HMGR和ADS，得到的转基因植株青蒿素含量得到明显提高的转基因株系。通过基因工程方法提高青蒿植株中青蒿素的含量为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法。在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，本发明得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，本发明的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

优选地，所述筛选包括如下步骤：PCR检测外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量。

优选地，所述PCR检测为：设计合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为转基因青蒿植株。

优选地，所述高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿植株中青蒿素含量，测定条件为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。

本发明具有如下的有益效果：本发明的共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g DW时，共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

附图说明

图1为植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads的构建示意图；

图2为实施例中转基因青蒿植株的PCR检测结果图；

图3为实施例中青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。

具体实施方式