[发明专利]适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用

权利要求书

1.一种转基因小麦定量的内标准基因引物，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种转基因小麦定量的内标准基因引物，其序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种转基因小麦定量的内标准基因引物的设计方法，其步骤是：

A、通过NCBI数据库BlastN筛选物种特异性好的基因，查找非同源区段设计引物，扩增区段如下，同时将上下游序列进行Primer-Blast，设置参数为：特异物种：禾本科；数据库：nr；

利用Primer5(Primer Co.Ltd.Canada)软件设计的符合无错配，低发夹结构，二聚体自由能低等要求的内标准基因引物，其信息见下表：

内标准基因引物序列

通过上述引物，利用绝对定量检测体系中的DNA拷贝数，同时通过与外源基因同时扩增，利用绝对相对定量法检测外源插入基因插入位点数与转基因成分所占比例；

B、实验材料：

16个不同物种种子：

35个不同小麦品种：

不同物种种子灭菌消毒取叶片：

挑选饱满干净的种子，70％(V/V)乙醇浸泡30秒，然后10％NaClO浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、28℃，220r/min萌动过夜，露白后放置于灭菌培养皿中滤纸上萌发至2叶期取幼嫩叶片；

提取DNA：

取幼嫩小麦叶片，采用改进的CTAB法抽提DNA，具体步骤如下：

1)取小麦幼嫩叶片0.1～0.5g放入烘干灭菌的研钵，倒入液氮迅速将叶片磨成粉末并装入2ml离心管中；

2)磨好的样品中加入0.9ml预热的CTAB缓冲液混匀，65℃水浴1小时，期间颠倒混匀3次；

3)加入5mol/L的醋酸钾214μl，氯仿158μl，上下颠倒混匀至氯仿层颜色加深，-20℃放置30min；

4)室温下10500r/min离心15min，吸取上清液700μl转移入新的1.5ml离心管，加入560μl异丙醇，70μl 3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀，室温放置10min；

5)10000r/min离心15min，弃上清，风干至异丙醇挥发完全；

6)加入500μl预冷的70％V/V乙醇浸洗沉淀，将沉淀悬起，使之脱离管底；

7)10500r/min离心5min，弃上清，自然干燥；

8)加入30μl TE缓冲液，0.1～0.2μl 10mg/ml RNase A，4℃过夜溶解，-20℃贮存备用；

C、Southern Blot鉴定位点数：

Southern杂交探针引物序列

用Takara的随机引物标记试剂盒进行探针的同位素标记；

D、物种特异性检测：

PCR反应体系：

10X EasyTaq Buffer；

2U EasyTaq Polymerase；

120μM dNTPs；

1μL模板DNA；

200μM上、下游引物，

ddH₂O补足至25μL；

PCR反应条件

预变性：95℃5min；

扩增：94℃40s；

Ta 40s；

72℃20s 40Cycle；

再延伸：72℃10min；

保温：10℃10min；

E、不同小麦品种间稳定性检测：

PCR反应体系：

10X EasyTaq Buffer；

2U EasyTaq Polymerase；

120μM dNTPs；

1μL模板DNA；

200μM上、下游引物；

ddH₂O补足至25μL；

PCR反应条件：

预变性：95℃5min；

扩增：94℃40s；

Ta 40s；

72℃20s 40Cycle；

再延伸：72℃10min；

保温：10℃10min；

确定两对引物做转基因小麦检测时的定性或定量检测内标准基因引物。

4.权利要求1或2所述的一种转基因小麦定量的内标准基因引物在小麦转基因定量检测中的应用。