[发明专利]适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物检验检疫小麦属作物、食品、深加工产品转基因检测领域，更具体涉及一种利用Real-time PCR基于PSG719(Ta PSG719gene，FJ497025.1)、UCB(Tu CypB gene，EU868840.1)基因小麦种属特异性区段设计的用于小麦转基因定量检测中内标准基因引物，同时涉及一种转基因小麦定量的内标准基因引物的设计方法，还涉及一种转基因小麦定量的内标准基因引物的用途。

背景技术

小麦作为世界第一大作物，由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究滞后于其它作物。近年来，我国在小麦转基因方面也取得了初步的进展，并获得了一批具有抗病虫、抗逆境及改善品质的转基因小麦新材料，部分品系已经进入环境释放阶段(尹钧，李永春我国小麦转基因研究的现状及发展趋势中国农业信息2009.13-17)。而人们也开始关注食品安全与健康，而与之相对的则是现有的转基因检测技术的发展仍然在缓步前行。

出于对转基因食品可能存在的未知安全隐患的忧虑，同时也是对消费者知情权的保护，各国政府纷纷立法设立相关的检测阈值以利于管理(C.A.Carter International Approaches to the Labeling of Genetically Modified Foods Agricultural Issue Center University of California 2003)。

a：计划0.9％，低于1％；b：暂未执行

而要对转基因食品所占成分进行定量，一个内标准基因就显得极为重要了：

1.烘焙处理或者深加工食品其中可能掺杂了其它的添加剂或者其它食品，因此，内标准引物可以鉴定所提取的DNA样品质量；

2.作为设置的一个阴性对照用以检测PCR是否正常；

3.可以对总的反应体系中的DNA进行定量；

4.由于具有物种特异性，因此，可以通过对外源基因与内源基因的进行比对，通过绝对相对定量来实现检测转基因成分比例的目的。

甚至可以毫不夸张地说，一个合适的内标准引物是定量检测转基因的前提和基础。而一个合适的内标准引物应该具有几个特点：

1.具有物种种属特异性；

2.在各个品种之间稳定存在，不存在拟等位基因；

3.基因组中拷贝数目确定且较低。

PSG719：小麦PSG719的启动子是一个具有花粉且在花粉发育中期直到花药成熟期间特异表达的启动子，它除了与小麦或大麦中的部分EST具有同源性外，与其他物种均不具有任何同源性，表明该基因具有极好的物种特异性(Ling Chen，Guangyuan He.Isolation and heterologous transformation analysis of a pollen-specific promoter from wheat(Triticum aestivum L.)Mol Biol Rep 2010 37：737-744)；

UCB：urartu cyclophilin B基因编码一个新的定位于内质网的亲环素B蛋白，该蛋白可能参与存储蛋白折叠，该基因在面包小麦中具有8个定位(Huimei Wu，Emma Wensley.Identification and analysis of genes encoding a novel ER-localised Cyclophilin B in wheat potentially involved in storage protein folding，Plant Science 2009 420-432)。然而通过本实验证明具有6个定位位点。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物，具有良好的小麦属物种特异性，优异的种间稳定性，定性检测极限为0.95个小麦基因组，定量检测为5个拷贝数的小麦基因组，通过Real-time PCR检测，线性关系良好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物的制备方法，方法易行，操作简便，通过生物信息学方法，筛选到符合要求的具有种属特异性、种间稳定性良好内标准基因。

本发明的再一个目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物在小麦转基因定量检测中的应用，定性检测极限为0.95个小麦基因组，定量检测为5个小麦基因组，通过Real-time PCR检测，线性关系良好。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：