[发明专利]一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺

权利要求书

1.一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤：

(1)以马链球菌兽疫亚种为出发菌，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变，选育得到不产β-溶血素及透明质酸酶且产透明质酸能力大大提高的遗传特性稳定的突变株，将其在斜面种子培养基上于32～38℃的温度培养18～24h后，接种至一级种子培养基中；

(2)将培养好的一级种子培养液接种至二级种子培养液中，于32～38℃下培养6～12h至该培养液中的菌群处于指数生长期的前期；

(3)将培养好的种子液接种至营养度较高的发酵培养基中，使菌体在下列条件下进行发酵生产：采用补料分批发酵，发酵液pH为5.0～9.0，温度为32～38℃，搅拌转速150～600rev/min，通气量1.0～15.0vvm，培养时间18～24h；

(4)结束发酵，将发酵液转移至提取储罐中，边搅拌边用20％三氯乙酸调pH值至3.0，静置过夜，用板框进行过滤并收集滤出液，然后用去离子水调节溶液中透明质酸的含量约为5g/L，测定该溶液的pH值，用2N的NaOH溶液将该溶液的pH调节至6.0～9.0；

(5)以10～100g/L的添加量加入特定型号的硅藻土并搅拌2h，用不锈钢板框进行过滤，收集滤出液；

(6)将另一种特定型号的硅藻土按照10～100g/L的添加量加入到上述滤出液中，搅拌2h，用不锈钢板框过滤，并收集滤出液；

(7)将1～10g/L的活性炭加入上述滤出液中，搅拌2h后用板框过滤并收集滤出液；

(8)取样测定单位体积的滤出液中透明质酸的含量，然后按照2∶1(质量比)的比例添加一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，边加边搅拌，全部加完后，继续搅拌2h；

(9)将上述混悬液进行板框过滤并得到沉淀；

(10)配置0.2～1.0mol/L的NaCl溶液，然后将上述沉淀用该氯化钠溶液溶解，溶解过程要不断搅拌，以加速溶解速率；

(11)将上述完全溶解后的溶液加入1～10g/L浓度的活性炭，搅拌2h后板框过滤并收集滤出液；

(12)将上述滤出液通过孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，收集滤出液；

(13)往上述滤出液中加入2～3倍体积的95％乙醇溶液，搅拌使原溶液中的透明质酸沉淀出来，至不再有沉淀产生时进行板框过滤，收集沉淀至洁净容器中，用95％乙醇洗2～3次，然后将沉淀放置于真空干燥箱内进行干燥；

(14)收集干燥后的产品并进行粉碎即得到最终的产品透明质酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中的选育方法为：以一株马链球菌兽疫亚种为出发菌株，采用在平板培养基中添加1～10％无菌绵羊血或0.01～0.1％透明质酸钠的筛选手段，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变育种技术，筛选得到表达量高、不产β-溶血素及透明质酸酶且遗传特性稳定的突变菌株。