[发明专利]一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸钠的微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺。

背景技术

透明质酸是一种广泛存在于动物结缔组织和某些微生物荚膜中，具有独特分子结构和理化性质的大分子酸性粘多糖，因其很高的粘弹性和极强的保水性，可以起到诸如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合以及改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老等作用，目前已被广泛应用于临床医学、制药及化妆品工业。

早期透明质酸是以动物组织如人脐带、鸡冠、牛眼玻璃体等为原料，经提取、除杂、沉淀和分级分离后制得的，这种方法因原材料来源有限，分离纯化复杂、成本高昂而逐渐被微生物发酵法所代替。后者具有产量不受动物原料资源限制，成本较低，分离纯化工艺简捷，易于规模化生产等优点。但是野生的透明质酸生产菌株普遍产量较低，由此造成的高成本问题使其不适用于规模化生产，为此，我们综合采用了多种诱变选育方法对一株野生菌进行了优选，最终得到了一株高产菌，其产量最高可达10g/L，由此大大降低了生产成本。后续的分离纯化工艺较之采用离子交换等方法来说大为简捷，提高了分离效率，最高收率可达80％。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种通过对菌体的改造使其在优化后的条件下高表达量的发酵生产透明质酸，并运用过滤、吸附、络合等分离纯化技术将目的产物与发酵液分离，最终制成满足市场需求的合格产品。使用本发明生产透明质酸钠可大幅度提高生物表达量，有效的降低生产成本，从而取得较好的市场收益的利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，包括以下步骤：

(1)以马链球菌兽疫亚种为出发菌，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变，选育得到不产β-溶血素及透明质酸酶且产透明质酸能力大大提高的遗传特性稳定的突变株，将其在斜面种子培养基上于32～38℃的温度培养18～24h后，接种至一级种子培养基中；

(2)将培养好的一级种子培养液接种至二级种子培养液中，于32～38℃下培养6～12h至该培养液中的菌群处于指数生长期的前期；

(3)将培养好的种子液接种至营养度较高的发酵培养基中，使菌体在下列条件下进行发酵生产：采用补料分批发酵，发酵液pH为5.0～9.0，温度为32～38℃，搅拌转速150～600rev/min，通气量1.0～15.0vvm，培养时间18～24h；

(4)结束发酵，将发酵液转移至提取储罐中，边搅拌边用20％三氯乙酸调pH值至3.0，静置过夜，用板框进行过滤并收集滤出液，然后用去离子水调节溶液中透明质酸的含量约为5g/L，测定该溶液的pH值，用2N的NaOH溶液将该溶液的pH调节至6.0～9.0；

(5)以10～100g/L的添加量加入特定型号的硅藻土并搅拌2h，用不锈钢板框进行过滤，收集滤出液；

(6)将另一种特定型号的硅藻土按照10～100g/L的添加量加入到上述滤出液中，搅拌2h，用不锈钢板框过滤，并收集滤出液；

(7)将1～10g/L的活性炭加入上述滤出液中，搅拌2h后用板框过滤并收集滤出液；

(8)取样测定单位体积的滤出液中透明质酸的含量，然后按照2∶1(质量比)的比例添加一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，边加边搅拌，全部加完后，继续搅拌2h；

(9)将上述混悬液进行板框过滤并得到沉淀；

(10)配置0.2～1.0mol/L的NaCl溶液，然后将上述沉淀用该氯化钠溶液溶解，溶解过程要不断搅拌，以加速溶解速率；

(11)将上述完全溶解后的溶液加入1～10g/L浓度的活性炭，搅拌2h后板框过滤并收集滤出液；

(12)将上述滤出液通过孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，收集滤出液；

(13)往上述滤出液中加入2～3倍体积的95％乙醇溶液，搅拌使原溶液中的透明质酸沉淀出来，至不再有沉淀产生时进行板框过滤，收集沉淀至洁净容器中，用95％乙醇洗2～3次，然后将沉淀放置于真空干燥箱内进行干燥；

(14)收集干燥后的产品并进行粉碎即得到最终的产品透明质酸钠。