[发明专利]激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高分子纤维可视化的制备方法，特别是涉及一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，用于直接观察细胞和高分子纤维相互作用，属于激光共聚焦显微镜成像领域。

背景技术

激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，在光学成像的基础上将分辨率提高了30-40％，扩大了传统荧光显微镜的运用范围，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

目前为止，在组织工程领域，激光共聚焦显微镜主要用于观察：(1)各种细胞活细胞群体的数量、分布和形态；(2)细胞及组织的内部微细结构的荧光图像或亚细胞结构的的荧光图像；(3)细胞内部活细胞间的信号传递，如亚细胞水平上观察诸如Ca²⁺、pH值，膜电位等生理信号；。(4)断层扫描与三维重建等模拟成像能力。

组织工程领域中，往往需要将细胞种植在生物材料基质(如高分子纤维)上，通过荧光染色后，再传统的进行激光共聚焦扫描显微镜观察的观察。在观察中，只有细胞能通过荧光染料显现出，而生物材料基质无法显示，细胞在高分子纤维上生长，只是单纯的将细胞染色，直接观察细胞在高分子纤维上的数量、分布及形态。这种忽视了生物材料基质(如高分子纤维)在激光共聚焦扫描显微镜中显现的观察方法，使的其得到的荧光图片缺乏高分子纤维的承托，图像缺乏空间感。

现在的研究中，没有刻意将生物材料基质在激光共聚焦显微镜中可视化便于观察的报道。以高分子纤维作为生物材料基质为例，通常会采用下面两种方法表示：

(1)高分子纤维用激光共聚焦显微镜的光学明场显示。由于高分子纤维不喊任何荧光物质，在常规的激光共聚焦显微镜设定激光的激发下均无荧光图像的采集，只能用明场表示(Mo等，2004)。明场图片以白色为底色，荧光图片以黑色为底色，二者重叠后，图像更模糊，所以少有报道将两种图片重叠；同时，激光共聚焦显微镜的明场成像特点要求材料的透光性必须较好，透光性越好，成像效果越清晰，透光性越差，成像效果越模糊，直至最终完全没有成像效果。这导致了较厚的高分子纤维和其他生物材料基质无法观察。

(2)小分子物质自组装，导致高分子纤维间接成像。存在一大类高分子纤维间接成像的报道，将一些小分子物质，如有利于细胞粘附的精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD)序列，通过自组装的形式粘附在高分子纤维表面加强生物相容性。为了观察RGD序列是否粘附，常常用荧光物质标记上述小分子。当RGD序列大量粘附于高分子纤维表面，高分子纤维在激光共聚焦显微镜下观察为明显的荧光成像(Grafahrend等，2010)。虽然本方法可以间接直接使高分子纤维成像。但其初衷并非是将高分子纤维可视化便于激光共聚焦显微镜观察，而是用于判断小分子自组装能力；同时，高分子纤维是通过小分子与细胞间接地相互作用，并非高分子纤维直接与细胞直接作用，不利于直接判定高分子纤维对细胞的数量、分布和形态等的影响。

无论是哪种方法都不能真正地清晰地在激光共聚焦显微镜下直接观察生物材料基质与细胞。所以，为了增强激光共聚焦显微镜图片的空间感，解决上述问题，需要一种能普遍地将生物材料基质(如高分子纤维)在激光共聚焦显微镜下可视化的制备方法，用于观察细胞的同时，直接观察生物材料基质。

发明内容

本发明的目的是提供一种在激光共聚焦显微镜下高分子纤维的可视化的方法，可直接用激光共聚焦显微镜观察生物材料，及同时观察细胞在生物材料上生长情况。

本方法的目的在于实现4种可能：(1)将高分子纤维染上颜色，可以再在激光共聚焦显微镜下直接观察高分子纤维的形貌成为可能；(2)在同一时间，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜直接观察固定后的细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能；(3)在同一时间，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能；(4)利用激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱，在同一位置，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜，连续地直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能。

为达到以上目的，本发明采用了如下的方法：

一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)高分子材料溶解在有机溶剂中，加热并冷凝回流至共聚物完全溶解，形成溶液I；

(2)溶液I中加入荧光染料A，搅拌溶解至完全溶解，形成溶液II；