[发明专利]一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的异构体的方法，其特征在于：所述的异构体为N-Acetyl-Ser-(d)Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp-(d)Lys-Pro及N-Acetyl-Ser-(d)Asp-(d)Lys-Pro，所述的方法包括：

以三苯氯甲基型树脂中的任一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得四肽树脂；其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C₁₈或C₈色谱柱进行分离纯化，获得所述的四肽异构体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的方法包括四肽树脂的制备：

(1)制备Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂：

以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂中的一种作为起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分钟，其中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；

在上述的树脂中，依次加入DIEA或DMAP、Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH，10-50℃反应0.5-5小时，所得树脂分别用异丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗涤，获得Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂；

(2)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-D-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤1所得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-D-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50℃反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50℃反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次，加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10-50℃反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-D-Lys(Boc)-Pro-树脂；

(3)制备Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤2所得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-D-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50℃反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50℃反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-D-Asp(otBu)-OH或Fmoc-Asp(otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10-50℃反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-D-Asp(otBu)--Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂；

(4)制备Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-Ser(tBu)-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤3所得Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50℃反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50℃反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10-50℃反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干；

(5)制备Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Ac-Ser(tBu)-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂或Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤4所得Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-Ser(tBu)-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50℃反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50℃反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10-50℃反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，得Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂或Ac-Ser(tBu)-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂或Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-D-Lys(Boc)-Pro-树脂；

(6)制备四肽异构体粗品

将步骤5吹干后的树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20-10℃的切肽试剂，所述的切肽试剂为TFA、H₂O或加入EDT/Thio中的任意一种以上组成的复合液，各组分的体积比分别为90-95/2-5/2-5/1-5，10℃-50℃反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20-10℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1-6次，低温冷冻干燥10-24小时，获得四肽异构体粗品，所述切肽试剂中，树脂的浓度为：5-50ml/g。