[发明专利]一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种四肽异构体的制备方法，具体的说本发明涉及一种利用固相多肽合成法合成四异构体的方法及其应用。

背景技术

N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro)，简写为Ac-S-D-K-P，它是一个氮端乙酰化的内源性四肽，广泛分布于体内各种组织及体液中。这个四肽主要由它的前体物胸腺素β4经由脯氨酰寡肽酶(POP)水解而释放。在血液中的浓度一般为纳摩尔级。Ac-S-D-K-P的药代动力学研究发现，Ac-S-D-K-P静脉注入体内后，很快就被降解，半衰期仅为4～5min。Ac-S-D-K-P在人体内通过两种机制从血浆中清除：①血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用；②肾小球滤过作用。其中血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用是Ac-S-D-K-P代谢的主要途径。

Ac-S-D-K-P是一种多功能性生理调控因子，具有多种生物学活性。早期报道，Ac-S-D-K-P可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其静止在G0期，而抑制造血干细胞的活性。随后发现Ac-S-D-K-P通过促进血管的生成可以提高表皮的再植能力，加速受损的无血管表皮移植的伤口愈合。Ac-S-D-K-P能够抑制MGM刺激的骨髓干细胞分化成巨噬细胞，从而起到抗炎作用。近来发现Ac-S-D-K-P对多种细胞的增殖具有抑制作用。

Ac-S-D-K-P是一种重要的抗多种器官纤维化的因子。Ac-S-D-K-P能抑制胶原等细胞外基质的合成。研究发现Ac-S-D-K-P对PDGF介导的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成均有抑制作用；进一步实验表明，Ac-S-D-K-P可能通过抑制血清中诸多因子或活性成分而发挥其抑制血清诱导刺激的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成及表达的作用，这可能与抗心脏纤维化的作用有关。除心脏纤维化以外，目前的研究在Ac-S-D-K-P对肾脏、肝脏、肺脏等器官纤维化方面，都能发挥一定的抗器官纤维化的活性。

Ac-S-D-K-P具有非常显著的抗纤维化和抗炎的特点，但由于其进入人体后，在体内ACE的作用下迅速降解，使其浓度大大下降，极大地限制了其生物活性的发挥。因此，提供一种结构稳定，能够抵抗体内ACE的降解作用并持久发挥其生物学功能的Ac-S-D-K-P类短肽具有重要意义，而截止目前，国内外尚未见相关研究报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种固相多肽合成四肽的方法，用本发明方法所合成的Ac-S-D-K-P的异构体，通过对部分氨基酸残基进行D型改构，使其能够抵抗体内ACE的降解作用，并能够持久发挥其生物学功能。为实现第一目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的异构体的方法，所述的异构体包括N-Acetyl-Ser-(d)Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp-(d)Lys-Pro及N-Acetyl-Ser-(d)Asp-(d)Lys-Pro，所述的方法包括：

以三苯氯甲基型树脂中的任一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得四肽树脂；其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C₁₈或C₈色谱柱进行分离纯化，获得所述的四肽异构体。

其中，所述的方法包括四肽树脂的制备：

(1)制备Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂：

以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂中的一种作为起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分钟，其中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g；

在上述的树脂中，依次加入DIEA或DMAP、Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH，10-50℃反应0.5-5小时，所得树脂分别用异丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗涤、获得Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂；

(2)制备Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂或Fmoc-D-Lys(Boc)-Pro-树脂：