[发明专利]一种高灵敏度酶联免疫吸附分析方法

说明书

技术领域    

    本发明涉及一种基于化学振荡动力学检测底物变化的高灵敏度酶联免疫吸附分析方法，属生物化学分析方法技术领域。

背景技术    

酶联免疫测定法自Engvall于1971年创立以来，以其简便、快速、无放射性等特点获得了超速发展，现已广泛地运用于生物医学研究及临床疾病诊断等领域。很多重要的疾病诊断标志物采用了酶联免疫测定，如测抗HAV、乙肝五项、抗HCV，抗HIV，梅毒抗体、优生优育TORCH系列、性病病原体的抗原或抗体、激素、肿瘤标志物、自身抗体、细胞因子、H BV-DNA、HCV-RNA、遗传病基因以及肿瘤基因等。酶联免疫测定为疾病早期发现、疾病诊断，治疗方案制定、疗效评价、以及血液检测等提供了性命攸关的实验数据。酶联免疫测定法在农药残留、药物检测、低浓度化学品分析上也得到了广泛应用。

经典的酶联免疫吸附分析法原理为，被测物通过抗原-抗体系统特异性地吸附活性酶；酶催化底物进行水解或氧化还原反应并导致底物吸光度的变化；利用酶标仪在特定波长下检测底物吸光度的变化值。在理想的双夹心法或间接法定量检测中，在特定反应条件下，在一定浓度范围内，吸光度的变化值与交联在抗原或抗体上酶的物质的量成近似正比，即与被检测的抗原或抗体浓度近似成正比。对于定性检测，可以通过统计方法确认诊断结果的截断值。因酶标仪是以分光光度法为检测基础的，分光光度法对底物的最低检测限一般高于10^-5mol/L，即使考虑到酶促反应数以千倍的放大作用，其检测限也远高于免疫放射法的检测限，即：只有高浓度的抗原或抗体才能被常规的酶联免疫测定法所检测。因分光光度法对底物检测方法的局限性，低浓度的诊断标志物用经典的酶联免疫测定法测不了或测不准，这也在一定程度上降低了常规酶联免疫法在疾病诊断中的敏感度和适用范围。

化学振荡是指在远离平衡态的开放化学反应体系中，中间物浓度在时间和空间上呈现有规律的周期性变化。化学振荡吸引了人们从理论和应用两个层面研究这一非线性化学现象。在理论方面，比利时物理化学家伊里亚·普里高津创立了耗散结构理论，解释了一个系统从混沌无序向有序转化的机理、条件和规律。在应用层面，运用化学振荡动力学分析法成功地进行了一系列有机物和无机物的检测。在化学振荡中，因化学反应和扩散的复杂性，某些物理量如中间产物浓度、电极电势等会随时间而周期性地变化，特定微量外加物的存在将影响振荡反应并产生相关的特征信号。1978年Tikhonova将在封闭体系中的经典化学振荡器用于Ru²⁺检测，通过对振荡过程中电极电势随时间变化的动力学曲线分析，建立了化学振荡动力学检测法。与传统比较,该方法具有简便快速、灵敏度高等优点。已测定了铊、汞、银离子，维生素K₃、B₂、B₆，也有用于CO、Cl₂、ClO₂等气体浓度的报导。因在封闭体系中的经典的以金属离子为催化剂的化学振荡不稳定，导致测定相对误差较大，1995年Rafael提出，将封闭体系改为在连续流动搅拌反应器中，利用分析物脉冲微扰技术，向远离平衡态的振荡体系中以脉冲的方式注入不同 浓度的被分析物种，观察振荡反应体系的特征信号的变化并与标准特征信号相比较，就能发现被分析物种浓度与特征信号的变化量之间的关系。目前这种方法已测定了没食子酸、咖啡因、柑桔汁中的维生素C、糖中的香蓝醛等。运用分析物脉冲微扰技术梁菊对过氧亚硝酸阴离子检测限达到2.25×10^-9mol/L，Guo对糠醛的检测限达到3×10^?9 mol L^?11。尽管化学振荡检测灵敏度非常之高，但化学振荡检测法对多种外加物非常敏感，选择性差，故化学振荡检测法多用于定量检测而非定性检测。

发明内容    

    本发明的目的是，为克服基于分光光度法的常规酶联免疫法敏感度不足的问题，用一种新的高灵敏的检测底物变化的方法代替分光光度法可以大幅度的提高分析灵敏度；因单纯的化学振荡法选择性低，无法进行定性检测，如果将高灵敏度的化学振荡动力学检测和具有专一性和灵敏度放大作用的酶催化动力学分析结合起来，将能克服化学振荡选择性低、不能进行定性测定的问题。