[发明专利]一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法

权利要求书

1.一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，其特征在于：选用不同的Proteobacteria亚纲的染色体带有选择标记的受体菌与携带不能自我转移(Tra-Mob+)并带选择标记质粒的供体菌，通过与样品三亲配对接合，供体菌的质粒在样品中的可自转(Tra+Mob+)广宿主质粒的协助下进入受体菌，接合子通过受体菌和供体菌带有的筛选标记进行筛选，再将筛选的含有可自转广宿主质粒的接合子在以石油烃为唯一碳源的培养基中培养，筛选能够降解石油烃的广宿主质粒。

2.按权利要求1所述的利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，其特征在于：所述筛选方法具体为：

1)制备微生物细胞悬液：取待测样品加入生理盐水中在摇床上震荡，而后将悬浮液静置，取上清液进行离心；沉淀置于LB液体培养基中重悬，充分涡流，待用；

2)供体菌和受体菌的活化和液体培养：分别将冻存的携带不能自我转移(Tra-Mob+)并带选择标记质粒的供体菌和染色体带有选择标记的受体菌在含有相应选择标记的LB固体培养基30℃下过夜培养；而后上述供体菌、受体菌单菌落分别接种于不含有选择标记的LB液体培养基中，30℃摇床过夜培养，待用；

3)三亲配对：用稀释10倍的LB培养液将步骤2)中生长充分的供体菌和受体菌培养液分别稀释至10^-2倍；分别取上述稀释后供体菌和受体菌与微生物细胞悬液混合，而后离心并用1/10LB液体培养基重悬上述沉淀，重悬后培养液滴至LB固体培养基中30℃下过夜培养，待用；

4)接合子筛选：刮取步骤3)中生长的菌苔，于无菌生理盐水中重悬培养物，用无菌生理盐水在无菌条件下稀释至10^-4，取0.1ml稀释度为10⁰-10^-1的上述重悬培养物涂布含受体菌的选择标记和供体菌质粒的选择标记的双选择标记的LB固体培养基中，置于30℃恒温培养箱中，过夜培养；

5)质粒小量制备和多样性验证：挑取步骤4)中接合子单菌落，接入上述含双选择标记的LB液体培养基中，30℃摇床过夜培养；而后采用SDS-碱解法提取接合子的质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳，筛选广宿主质粒；

6)质粒石油烃代谢功能验证：将上述所得接合子接种于以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基中培养，具有石油烃降解能力的接合子在液体培养基中会表现出生长，待培养液中培养基变浑浊，OD600明显变化，即为该接合子含有以石油烃为唯一碳源的广宿主石油烃代谢质粒；

或将上述所得接合子点种在以多环芳烃组分为唯一碳源的固体双层平板上30℃培养，具有石油烃降解能力的接合子在液体培养基中会表现出生长，并将固体平板在紫外光下，菌落周围培养基在紫外光下的吸收减弱，菌落周围出现降解暗圈，即该接合子含有以多环芳烃为唯一碳源的广宿主石油烃代谢质粒。

3.按权利要求2所述的利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，其特征在于：所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7.2-7.4；LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入2％重量的琼脂粉。

4.按权利要求2所述的利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，其特征在于：所述供体菌为E.coli JM109(pBBR1MCS)(质粒编码氯霉素抗性)，E.coli JM109(pBBR1MCS-5)(质粒编码庆大霉素抗性)或E.coli DH5(pSU4814)(质粒编码氯霉素抗性)；受体菌为E.coli K12rif(利福平抗性)、E.coli K12nal(萘啶酸抗性)、P.putida UW3(利福平抗性)或C.necator JMP228(利福平抗性)。

5.按权利要求2所述的利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，其特征在于：以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基：取5g/L石油烃组分母液，0.22μm滤膜除菌，量取50-200μl母液，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使底物的终浓度为50-200mg L^-1。