[发明专利]一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学技术和污染土壤生物修复技术交叉领域，具体的说一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法。

背景技术

石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳香烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物，是人类最主要的能源之一。但是，随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，其中原油开采和冶炼过程中的工业污水排放和溢油泄漏事故是导致土壤石油烃污染的主要原因，不仅破坏了生态环境，还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。特别是多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期较长，并且大多具有致畸、致癌和致突变效应，因此成为人类健康的巨大威胁。我国石油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不同程度的石油烃污染。因此，对石油烃污染土壤进行修复、恢复其生态功能以保障农产品安全是一项十分迫切的任务。

环境中的微生物由于其高度的遗传多样性和功能多样性，在污染物降解过程中发挥着重要作用，从实验室分离高效功能微生物并投加到环境中加速污染物的代谢是目前主要采用的微生物修复方式。但由于接种的高效降解菌与土著微生物在营养和空间上的竞争及环境中的各种不利条件，往往导致接种的功能微生物很难存活，不能持久发挥生物修复作用。这一问题成为制约生物修复技术高效、持久发挥作用的“瓶颈”。为解决上述“瓶颈”问题，一些学者提出接种携带特定降解基因的广宿主可自我转移质粒(Self-transmissible broad host range plasmids)，接种后，随着广宿主代谢质粒在环境中的水平基因转移，代谢基因转移至土著细菌并在其中表达，可使具有竞争性的土著微生物获得降解能力，从而不必考虑供体菌的存活条件。这种由广宿主质粒水平基因转移介导的生物修复提出了与传统生物修复技术完全不同的思路和概念，有望成为一种新的污染物生物修复途径。

所谓的“广宿主质粒”被定义为至少能够在变性细菌(Proteobacteria)两个亚纲(例如β-，γ-)之间互相转移并稳定传代的质粒。广宿主质粒的结构一般由两个区域组成，一个是质粒骨架(与质粒的复制、稳定性和可转移性有关)，一个是装配基因(能够赋予宿主特定的表型，例如抗药性、金属抗性、降解污染物特性等)。这两个区域一般形成“嵌合”结构(如附图1所示)，并都具有遗传多样性。

目前仅有少数广宿主质粒进行了全序列分析或者遗传特性鉴定，在2004年以前进行全序列分析的广宿主质粒仅有7个。并且研究比较透彻的可自我转移广宿主质粒，大都是从可培养的宿主中分离的，提取质粒后进行广宿主性和遗传多样性分析，即所谓的“内源分离法”。但这种方法存在着很大的局限性，首先，大部分细菌是不可培养的，因此这种传统的从可培养宿主中分离质粒的方法大大降低了发现新的广宿主质粒的几率；其次，这种方法不涉及质粒的转移过程，因此在分离过程中不能确定所分离质粒的自我转移特性。为了避免这一问题，发展了“外源质粒分离”方法，其中在国外应用较早的是“双亲配对法”。双亲外源质粒分离法的基本原理是，环境样品本源微生物群落作为广宿主质粒供体，通过与合适受体菌之间的接合转移，然后通过质粒所编码的特定表型特征(例如重金属抗性或者降解污染物的能力)筛选接合子，从而从环境样品中获得广宿主质粒。但这种方法的局限性在于所分离的质粒必须具有特定的表型特征，才能作为筛选接合子的标记。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，选用不同的Proteobacteria亚纲的染色体带有选择标记的受体菌与携带不能自我转移(Tra-Mob+)并带选择标记质粒的供体菌，通过与样品三亲配对接合，供体菌的质粒在样品中的可自转(Tra+Mob+)广宿主质粒的协助下进入受体菌，，接合子通过受体菌和供体菌带有的筛选标记进行筛选，再将筛选的含有可自转广宿主质粒的接合子在以石油烃为唯一碳源的培养基中培养，筛选能够降解石油烃的广宿主质粒。

所述筛选方法具体为：

1)制备微生物细胞悬液：取待测样品加入生理盐水中在摇床上震荡，而后将悬浮液静置，取上清液进行离心；沉淀置于LB液体培养基中重悬，充分涡流，待用；