[发明专利]猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建、鉴定法及用途

权利要求书

1.猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、根据载体的信息和靶序列设计3对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，所述9个核苷酸为：TTCAAGAGA；

2)、RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤1)为：

根据猪FLJ全长序列，筛选并设计3对siRNA引物；所述3对siRNA引物分别为：

引物1：

SENSE：5′-GATCCCTGTCGCTGGCCGACAGCATTCAAGAGATGCTGTCGGCCAGCGACAGTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAACTGTCGCTGGCCGACAGCATCTCTTGAATGCTGTCGGCCAGCGACAGG-3′；

引物2：

SENSE：5′-GATCCGCTGTTCATGCCCCGCAGCTTCAAGAGAGCTGCGGGGCATGAACAGCTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAAGCTGTTCATGCCCCGCAGCTCTCTTGAAGCTGCGGGGCATGAACAGCG-3′；

引物3：

SENSE：5′-GATCCGGACGTCTACGGCTACTCCTTCAAGAGAGGAGTAGCCGTAGACGTCCTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAAGGACGTCTACGGCTACTCCTCTCTTGAAGGAGTAGCCGTAGACGTCCG-3′

3.根据权利要求2所述的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤2)为：将pSilencer4.1-CMV neo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。

4.对如权利要求1～3任一方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法，其特征是：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用测序鉴定；测序引物为CMV-F：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

5.如权利要求1～3任一方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的用途，其特征是：用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。

6.根据权利要求5所述的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途，其特征是包括以下步骤：

1)、将含FLJ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；

2)、将含FLJ的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪肌内脂肪细胞或其他哺乳动物细胞，37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；

3)、转染48h后，分析siRNA表达载体对FLJ及脂肪代谢关键功能基因FAS、ACC、ATGL、HSL基因表达的影响，从而研究FLJ基因的功能。