[发明专利]猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建、鉴定法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪FLJ基因小干扰RNA(siRNA)有效表达载体的构建、鉴定及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

FLJ基因是本课题组通过基因芯片技术筛选获得的与猪肌内脂肪沉积密切相关的新基因。人类FLJ是2003年测序筛选出来的新基因，功能尚未确定。本本课题组根据猪FLJ基因已知的EST序列，通过RACE技术，克隆得到FLJ全长cDNA序列，FLJ基因全长cDNA序列有2793bp(GenBank登录号EU030283)，其中包括283bp 5′非编码区(5′-untranslated region，5′-UTRs)、714bp编码区(coding region，CDs)和1796bp的3′非编码区(3′-UTR)，编码区翻译237个氨基酸(GenBank登录号ABS29571)；BLAST结果表明，FLJ氨基酸序列序列与人、鼠同源性分别达到99％，84％。这为后续研究FLJ基因的功能奠定分子生物学基础。

RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的基因阻断技术，具有低成本、高效性及高特异性等特点，能特异、高效地抑制特定基因的表达，已经成为研究基因功能的一种有力工具。由于干扰载体pSilencer 4.1-CMV neo可以方便用于目的基因siRNA表达载体的构建，从而可以特异性的使特定目的基因沉默，功能丧失，因此干扰载体pSilencer 4.1-CMV neo可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体，以及该小干扰RNA表达载体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)、根据载体的信息和靶序列设计(并合成)3对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，该9个核苷酸为：TTCAAGAGA；

2)、RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。

作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为：根据步FLJ全长基因序列，筛选并设计3对siRNA引物；该3对siRNA引物分别为：

引物1：

SENSE：5′-GATCC CTGTCGCTGGCCGACAGCA TTCAAGAGA TGCTGTCGGCCAGCGACAGTT A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT AACTGTCGCTGGCCGACAGCA TCTCTTGAA TGCTGTCGGCCAGCGACAG G-3′

引物2：

SENSE：5′-GATCC GCTGTTCATGCCCCGCAGC TTCAAGAGA GCTGCGGGGCATGAACAGCTT  A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC TCTCTTGAA GCTGCGGGGCATGAACAGC G-3′

引物3：

SENSE：5′-GATCC GGACGTCTACGGCTACTCC TTCAAGAGA GGAGTAGCCGTAGACGTCCTT A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT AAGGACGTCTACGGCTACTCC TCTCTTGAA GGAGTAGCCGTAGACGTCC G-3′

作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤2)为：将pSilencer 4.1-CMV neo质粒进行BamH I和Hind III双酶切后，与siRNA引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。

本发明还同时提供了对利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用测序鉴定；测序引物为CMV-F：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

本发明还同时提供了利用上述方法构建所得的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途：用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。

作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途的改进，包括以下步骤：

(1)将含FLJ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；