[发明专利]一种杨树单倍体培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单倍体植物的培育方法，特别涉及一种采用植物组织培养获得杨树单倍体的培育方法，属于杨树单倍体的选育领域。

背景技术

北京杨(Populus beijingensis)为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点，是优良的用材林、防护林、行道树和“四旁”绿化树种，主要分布于中国的华北和西北等地区，深受群众喜爱。

杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将其进行加倍成为双单倍体(doubled haploids，DHs)，这样就明显的缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。

目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是，以杨树花药为外植体选育杨树单倍体的培养过程中一直存在愈伤组织诱导率低、愈伤组织器官分化率低等问题，导致现有的杨树单倍体的培育方法远远不能满足研究和生产实践的需求，亟待改进。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有的杨树单倍体的培育方法中所存在的不足，提供一种新的杨树单倍体的培育方法，该方法的杨树花药愈伤组织诱导率高、愈伤组织的器官分化率和不定芽的生根率高，可以在较短时间内形成大量优良的杨树单倍体试管苗，可进行规模化、工厂化生产。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种杨树单倍体的培育方法，包括：

1)将消毒处理后的杨树花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织；

2)将杨树愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得杨树不定芽；

3)将杨树不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，获得试管小苗；

4)经过倍性鉴定，获得杨树单倍体植株。

其中，所述的杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)。

为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率；其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，这些方法或手段均为本领域技术人员所通晓；本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。

由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤1)中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果：

1-A)用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽；

1-B)用酒精浸泡花芽；

1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗；

1-D)吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。

优选地，步骤1-A)中无菌水冲洗次数为4-5次；步骤1-B)中所述酒精的体积百分比浓度为70.0％；浸泡时间为30s；步骤1-C)中次氯酸钠的质量百分比浓度为7.0％；表面灭菌时间为5min；无菌水冲洗次数为3-5次。