[发明专利]一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其用途

权利要求书

1.一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法，主要由以下步骤组成：

(1)核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建

选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein，bbp)作为突变库的模板，根据bbp序列及结构，设计随机突变位点，，随机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T；K为G和T)，Acticalin抗体库构建由PCR完成，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Acticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库转录后的RNA分子包括一个5’-loop和3’-loop茎环结构，一个核糖体结合位点，突变的bbp库，C末端间隔序列等，全长约950bp；

(2)氨苄青霉素特异结合物的筛选

将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用Amp-BSA和Amp-PLL(多聚赖氨酸，polylysine，PLL)作为抗原固相交替筛选氨苄青霉素的特异结合物，通过改变Mg²⁺浓度将筛选得到的特异结合物-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库；然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟抗体DNA文库；经过七轮核糖体展示筛选后，抗体文库中抗原阳性的抗体得以富集；

(3)anticalin-amp的可溶性功能表达

将七轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子中有5株序列相同，将该基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中；

(4)anticalin-amp的纯化与鉴定

利用Anti-His tag亲和层析柱对表达的anticalin-amp进行了纯化，使目的条带得到了明显的浓缩和分离，直接ELISA分析其结合活性，间接竞争ELISA分析其竞争结合活性。

2.权利要求1所述随机突变库的模板可以是其他lipocalin分子，优选bbp。

3.权利要求1所述筛选方法中的包被原可以选用氨苄青霉素-BSA，还可以选用氨苄青霉素-PLL进行筛选，优选交叉筛选。