[发明专利]一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别氨苄青霉素的高效特异结合物与研制可以快速检测氨苄青霉素残留的免疫速测试剂盒的用途。

背景技术

氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，别名：氨苄西林、氨苄青、安比西林等，分子式为C16H19N3O4S，分子量为349.41。氨苄青霉素游离酸含3分子结晶水，为白色结晶性粉末，味微苦，在水中微溶，不溶于氯仿、乙醇、乙醚或脂肪油，溶解于稀酸或稀碱溶液，pKa为2.5和7.3。由于在治疗家禽疾病过程中超量应用Amp，并通过食物链传递给人，使经常食用的人对Amp的耐药性增加。由于Amp的抗菌作用，使肠道细菌菌群混乱，引起出血性结肠炎。Amp的使用还会引起过敏性哮喘、过敏性休克等。在马、猪中出现流汗、不安、呼吸困难、站立不稳、心跳加速等症状。大剂量或超大剂量使用青霉素类兽药，可干扰凝血机制而造成出血或引起中枢神经系统中毒，引起动物抽搐、大小便失禁、瘫痪等症状。

Lipocalin是从细菌到人都含有的一组胞外亲脂蛋白的总称，作为受体较强的结合小分子具有重要的生物学功能。这类蛋白能够结合和转运血浆中的疏水性生物活性因子，也可用于运输和储藏次级代谢产物如脂质、信息激素、前列腺素等。尽管lipocalin在一级结构上存在多样性，但其二级结构与四级结构却惊人的相似：由N末端环、α螺旋、C末端环、β片层形成的刚性结构核心组成，其形状象一个洞穴。而8条反相平行的β折叠片与一个α螺旋扭曲形成一个折叠桶，称作β-桶，形成了“Lipocalin支架”结构。桶的一个末端有溶解能力并含有一个配体结合位点，开口端由连接β条带的多个Loop组成，是整个分子比较柔韧的部分，且氨基酸成员为极性氨基酸，Loop1、Loop2、Loop3、Loop4是其随机突变的区域，β桶的反相末端由短的环封闭。侧链充满了β-桶的下层部分，形成蛋白质的疏水核心。最近，设计Lipocalin支架作为非天然配体用于蛋白质特异性的研究。通过设计lipocalin的支架可模拟抗体与小分子结合，这些设计的lipocalin突变体称为Anticalin，具有配体特异性。据此我们可采用随机突变抗体库技术制备具有抗体功能的特异识别结合分子，类似于抗体与抗原之间的关系。

核糖体展示技术(ribosome display，RD)是一种体外展示技术，基因型(DNA序列)和表型(蛋白质)可以联系起来，即将可扩增的基因组信息DNA或RNA与可选择的突变体蛋白质联系在一起。RD技术中mRNA缺乏终止密码子并经过适当修饰，在体外翻译过程中核糖体会停留在mRNA的3′末端，形成十分稳定的“mRNA-核糖体-蛋白质”三元复合物，这种三元复合体形式将蛋白质和mRNA信息连接到一起，应用RD可进行特殊功能的肽和蛋白质筛选。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种潜在的检测用氨苄青霉素特异结合物。

本发明的第二个目的提供一种氨苄青霉素特异结合物的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供的抗氨苄青霉素特异结合物是从核糖体展示anticalin模拟抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。

本发明提供的抗氨苄青霉素特异结合物的制备方法为：

1.核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建

选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein，bbp)作为突变库的模板，根据bbp序列及结构，设计随机突变位点，，随机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T；K为G和T)，Anticalin抗体库构建由PCR完成，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Anticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库，该库转录后的RNA分子包括一个5’-loop和3’-loop茎环结构，一个核糖体结合位点，突变的bbp库，C末端间隔序列等，全长约950bp。

其中突变库的模板可以是其他lipocalin分子，优选bbp

2.氨苄青霉素特异结合物的筛选