[发明专利]果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)筛选菌株：对多株曲霉属菌株进行发酵，收集菌丝获得含果糖赖氨酸酶的粗提液，以果糖赖氨酸和果糖基赖氨酸多肽为底物、利用醌法测定果糖赖氨酸酶的活性，筛选出产高活性果糖赖氨酸酶的曲霉菌株11-82；

(2)培养：用培养基培养11-82曲霉菌株，收集菌丝并清洗；

(3)初提：取已清洗的菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；菌丝与缓冲液的重量体积比为1∶3～5；

(4)硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤(3)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；

(5)疏水层析：用buffer A平衡疏水层析柱，再将步骤(4)得到的粗提液上样吸附，吸附结束后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；

(6)亲和层析：将除果糖赖氨酸以外的果糖氨基酸偶联到固相化载体上，用buffer A平衡层析柱后，将经疏水层析柱洗脱后的洗脱液上样，进行亲和吸附，吸附后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液；

其中：buffer A为以5～15mM、pH8～8.5的Tris-Hcl缓冲液作为底液进行配制的15％～30％的饱和硫酸铵。

2.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中11-82曲霉菌株为自行筛选的菌种，分类命名为黑曲霉，拉丁文学名为Aspergillus niger，于2011年10月21日在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5364。

3.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中培养基的成分包括果糖赖氨酸5～10g/L、葡萄糖5～15g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钠0.5～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.8g/L、氯化钙0.05～0.2g/L、维生素混合溶液0.5～2‰、金属离子混合溶液0.5～2‰，培养基的pH为4.5～6.5，其中维生素混合溶液的成分包括V_B1·Hcl 0.5～1.5g/dL、核黄素1.5～2.5mg/dL、泛酸钙1～3mg/dL、V_B6·Hcl 1～3mg/dL、生物素0.05～0.2mg/dL、氨基苯甲酸0.5～2mg/dL、烟碱酸1～3mg/dL、叶酸0.05～0.15mg/dL，金属混合溶液的成分包括硫酸镁1～3g/L、硫酸锌1.5～3g/L、硫酸铜0.1～1g/L、氯化钴0.1～0.5g/L、钼酸钠0.2～0.3g/L、硼酸0.2～0.6g/L、碘化钾0.01～0.15g/L。

4.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-Hcl缓冲液。

5.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中固相化载体为NHS-activated Sepharose 4 fast Flow或CNBr-activated Sepharose 4 fast Flow。

6.一种糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：由以下两种试剂构成，其中：

试剂1：

试剂2：

7.根据权利要求6所述的糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。

8.根据权利要求6所述的糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮或proclin300中的一种。

9.根据权利要求6所述的糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为甘油、吐温-20中的一种。