[发明专利]果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种在医学检验中使用的果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病是发生在高血糖人群中的一类代谢型疾病，可导致机体多数系统受到严重的损害，尤其是神经及血管。根据世界卫生组织预计，中国糖尿病人数已居世界第二位。糖尿病将成为未来50年中国最严重的公共卫生问题。

糖化白蛋白(Glycated albumin，GA)是指人血清中葡萄糖与白蛋白N末端发生非酶促糖化反应而形成的产物，其中90％与白蛋白链内的赖氨酸ε-NH2残基发生反应，其反应原理为两者首先形成不稳定的葡基胺(Glycosylamine)或Schiff碱基(Schiff Base)，后者再经不可逆的葡糖胺(Amadori)重排反应形成稳定的氨基酮(酮胺)。因白蛋白的半衰期大约是20天，所以糖化白蛋白检测可被用于检测过去2-3周平均血糖水平。目前，糖化白蛋白已成为一项糖尿病患者必不可少的检测项目，与糖化血红蛋白相比，其更适合作为评估糖尿病透析患者住院治疗及死亡风险的指标。

所以如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白。其反应原理为首先使用蛋白酶将糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应生成多肽(或氨基酸)，葡萄糖醛酮和H₂O₂。释放的H₂O₂通过终点反应比色法来测定，其在600nm处的吸收值与糖化白蛋白的浓度成比例。具体反应过程如下：

由上述反应原理和反应步骤可知，果糖氨基酸酶为糖化白蛋白测定中的关键酶，果糖氨基酸酶成为能否精确地测定人血清中糖化白蛋白的关键。适用于糖化白蛋白测定的果糖氨基酸酶需具有以下特点：

1、特异性高：对果糖赖氨酸及果糖赖氨酸多肽具有高活力，对除果糖赖氨酸以外的其他果糖氨基酸低活力或者没有活力；

2、活力高；

3、热稳定性好；

4、pH作用范围广，pH稳定性好。

而目前市场上现有测定糖化白蛋白的进口试剂盒存在稳定性差(为干粉状)、所需酶量大、特异性不高等缺点，因此要求开发高活性的果糖氨基酸酶以解决上述弊端。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种果糖赖氨酸酶的制备方法，该方法制备步骤简单，且得到的果糖赖氨酸酶纯度高、活性高、反应特异性高。

本发明所采用的技术方案为：

一种果糖赖氨酸酶的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)筛选菌株：对多株曲霉属菌株进行发酵，收集菌丝获得含果糖赖氨酸酶的粗提液，以果糖赖氨酸和果糖基赖氨酸多肽为底物、利用醌法测定果糖赖氨酸酶的活性，筛选出产高活性果糖赖氨酸酶的曲霉菌株11-82；

(2)培养：用培养基培养11-82曲霉菌株，收集菌丝并清洗；

(3)初提：取已清洗的菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；菌丝与缓冲液的重量体积比为1∶3～5；

(4)硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤(3)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；

(5)疏水层析：用buffer A平衡疏水层析柱，再将步骤(4)得到的粗提液上样吸附，吸附结束后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；

(6)亲和层析：将除果糖赖氨酸以外的果糖氨基酸偶联到固相化载体上，用bufferA平衡层析柱后，将经疏水层析柱洗脱后的洗脱液上样，进行亲和吸附，吸附后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液；

其中：buffer A为以5～15mM、pH8～8.5的Tris-Hcl缓冲液作为底液进行配制的15％～30％的饱和硫酸铵。

所述步骤(1)中11-82曲霉菌株为自行筛选的菌种。11-82曲霉菌株分类命名为黑曲霉，拉丁文学名为Aspergillus niger，保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年10月21日，保藏编号为CGMCC No.5364。